国家重点研发计划|南昌大学鄢祥辉博士:樟树籽仁源α-葡萄糖苷酶抑制肽的制备工艺优化及其抗氧化活性

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入选中国科技期刊卓越行动计划

本文获国家重点研发计划重大专项课题（2023YFF1103502）。

摘要

为高值化开发利用我国资源丰富的樟树籽、筛选樟树籽仁源α-葡萄糖苷酶抑制肽，本研究以樟树籽仁蛋白为原料，采用水解度（DH）和α-葡萄糖苷酶抑制率作为评价指标，通过单因素和正交试验优化制备得到樟树籽仁源α-葡萄糖苷酶抑制肽，并测定分析其氨基酸组成和体外抗氧化活性。结果表明，樟树籽仁源α-葡萄糖苷酶抑制肽的最优酶解工艺为：以木瓜蛋白酶为水解酶，底物浓度为2%（w/v）、酶解温度为55 ℃、酶解pH为6.0、酶解时间为2.0 h、酶添加量为16000 U/g，该条件下樟树籽仁蛋白酶解物的DH为26.81%。制得的樟树籽仁源α-葡萄糖苷酶抑制肽对α-葡萄糖苷酶、DPPH自由基和ABTS+自由基的半数抑制率（IC50值）分别为11.52、5.42和0.64 mg/mL。本研究为樟树籽仁源α-葡萄糖苷酶抑制肽的挖掘提供了理论依据。

作为最古老且有效的食品保鲜技术，低温贮藏在维持肌肉食品、水果和蔬菜的安全及质量方面发挥着关键作用，根据贮藏环境温度的不同，现代工业中通常以冷藏（0~4 ℃）和冷冻（低于−18 ℃）两种方式来提高产品的品质稳定性。近年来，与传统肉制品相比，调理牛排因其食用方便、营养均衡等优势，越来越受到消费者的青睐。调理牛排产品通常采用冷藏或者冷冻方式进行贮运销售。传统的冷藏技术货架期较短，难以进行长线的冷链运输；此外，尽管冷冻技术可以大幅度延长货架期，但是贮藏过程中冰晶的生长/再结晶会对肌肉组织造成剧烈的机械损伤，解冻后过多的汁液损失会直接损害行业的经济效益和消费者的健康需求。因此，有必要开发新型的低温保存技术以维持食品原有的品质。

糖尿病是由于体内胰岛素相对或绝对不足引起的糖、蛋白质和脂肪代谢紊乱的一种综合性病症，其特征为血糖和尿糖过高。持续的高血糖和长期代谢紊乱等可导致全身组织器官，特别是肾、眼、神经系统及心血管的损害和功能衰竭或障碍。严重者可引起电解质紊乱，失水和酸碱平衡失调等急性并发症，如酮症酸中毒和高渗昏迷。糖尿病发病率日益增多，已成为世界性的多发病、常见病，是仅次于肿瘤和心血管疾病的第三大疾病。而α-葡萄糖苷酶抑制剂可限制肠道对碳水化合物的转化，从而降低餐后血糖。该活性涉及对小肠内各种α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制，降低淀粉分解为葡萄糖的速率，从而减缓肠道对葡萄糖的吸收。 

近年来，以植物蛋白作为α-葡萄糖苷酶抑制肽的潜在来源得到了广泛关注。例如，邓永蓉等将蚕豆蛋白经蛋白酶酶解后，再通过膜分离技术制备得到分子量为3~5 kDa的酶解多肽，当浓度为32 mg/mL时其α-葡萄糖苷酶抑制率可达86.56%。Yang等通过蛋白酶酶解花生蛋白，其酶解多肽表现出良好的α-葡萄糖苷酶抑制效果，其半数抑制率（IC50值）为5.63 mg/mL。Hu等从发酵米糠中分离出新型寡肽，当浓度达到12 mg/mL时其α-葡萄糖苷酶抑制率为30%。薛森等将β-伴大豆球蛋白进行胃肠道模拟消化，通过虚拟筛选和药物动力学方法获得了多个α-葡萄糖苷酶抑制肽，其中四肽EASY对α-葡萄糖苷酶的IC50值为208.6 μg/mL。以上研究均表明植物蛋白来源的多肽具有作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜在应用价值。 

我国樟树（Cinnamomum camphora）资源十分丰富，樟树主要生长于我国淮河以南、珠江以北亚热带区域的15个省市。据估算，我国现有樟树的樟树籽年产量达1100万吨以上、居世界首位。但目前，大部分樟树籽仍处于自熟落果、无人收购状态，既污染环境又造成了严重的资源浪费。樟树籽仁的营养成分丰富，其籽仁含油脂（56%~62% w/w）、蛋白质（18%~25% w/w），是全球唯一、中国独有的天然中链油（中链脂肪酸含量达95%以上）资源。樟树籽仁蛋白的必需氨基酸含量丰富（33.33%），与大豆分离蛋白（32.45%）相近。此外，樟树籽仁蛋白还含有丰富的疏水性氨基酸（丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸等）。研究表明，多肽中疏水性氨基酸的含量与其α-葡萄糖苷酶抑制活性呈正相关。因此，樟树籽仁蛋白是制备α-葡萄糖苷酶抑制肽的良好来源，而关于樟树籽仁蛋白的α-葡萄糖苷酶抑制活性和潜在抗糖尿病作用未见报道。 

酶法水解食品蛋白质制备生物活性肽具有绿色安全、过程易控制、条件温和、生产成本低和易规模化生产等特点，在实际生产中应用最广。酶法水解主要是通过生物酶破坏主链中的肽键修饰蛋白质结构，从而达到改善蛋白质功能特性（溶解性、起泡性、凝胶性、乳化性等）和生物活性（抗氧化、抑菌、降血糖、降压等）的目的。随着人口的急剧增长，动物资源的短缺直接限制了降血糖相关资源的获取，如动物多糖、动物蛋白肽等。反之，植物蛋白来源丰富且获取成本低，从植物蛋白中获取和利用降血糖肽是当前研究的新趋势。 

本研究以樟树籽仁蛋白为原料，以樟树籽仁蛋白酶解液α-葡萄糖苷酶抑制活性为主要指标、水解度为辅助指标，通过单因素实验和正交优化得到酶解樟树籽仁蛋白的最适蛋白酶及其最佳酶解工艺参数，并对最佳工艺条件下制得的樟树籽仁源α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸组成及体外抗氧化活性进行评价。旨在为高值化开发利用我国资源丰富的樟树籽提供理论依据，为植物源降血糖肽的酶法制备提供参考。

结果与分析

2.1   蛋白酶的筛选

图  1不同蛋白酶对酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率与水解度的影响

Figure  1.Effect of different proteases on α-glucosidase inhibition rate and degree of hydrolysis of enzymatic products

注：不同字母代表同一指标不同样品间存在显著性差异（P<0.05），图2~图8同。

2.2   单因素实验结果分析

2.2.1   酶解温度对樟树籽仁蛋白酶解产物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

如图2所示，随着酶解温度的升高，樟树籽仁蛋白酶解产物（10 mg/mL）的水解度与α-葡萄糖苷酶抑制率呈现先上升后下降的趋势。在35 ℃至55 ℃区间内，水解度与抑制率呈上升趋势。酶解温度到达55 ℃时，水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率均达到最大值，分别为18.93%和35.02%。在酶解温度低于55 ℃时，樟树籽仁蛋白分子结构随着温度的升高而逐渐展开，使其暴露出更多的酶切割位点，因此更有利于被木瓜蛋白酶水解。当酶解温度为55 ℃至75 ℃区间时，酶解产物的水解度随着酶解温度的升高先下降后上升，但均显著低于55 ℃时的水解度（P<0.05）；此外，酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率随着酶解温度的升高而显著下降（P<0.05），从35.02%降低至18.92%。温度影响酶对底物的催化反应，在最适温度以前，随着温度的升高，酶活力逐渐增大，因此水解度与α-葡萄糖苷酶抑制率也随之增大；超过最适温度后，木瓜蛋白酶的空间结构发生变化，使酶的催化作用减弱甚至丧失；继续升温会导致酶失活，导致底物蛋白的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率都降低。因此，选定55 ℃作为最佳酶解温度进行后续实验。

图  2酶解温度对酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率与水解度的影响

Figure  2.Effect of enzymatic hydrolysis temperature on α-glucosidase inhibition rate and degree of hydrolysis of enzymatic products

2.2.2   酶添加量对樟树籽仁蛋白酶解产物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

如图3所示，樟树籽仁蛋白酶解产物（10 mg/mL）的水解度与α-葡萄糖苷酶抑制率随着酶添加量的增大而呈现先上升后下降趋势，在木瓜蛋白酶添加量16000 U/g时，酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性最好，其抑制率为42.23%，水解度为21.91%。超过此添加量后，α-葡萄糖苷酶抑制率显著下降（P<0.05）。这是因为在酶添加量较少时，随着酶添加量的增加，酶与底物蛋白的接触更加充分，从而有利于水解反应的进行，底物蛋白可被持续酶解产生更多具有抑制α-葡萄糖苷酶的肽段，因此酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率在不断升高。随着酶添加量从16000 U/g增加至18000 U/g，蛋白酶可能会微量水解先前已生成并具备α-葡萄糖苷酶抑制活性的氨基酸肽段，使肽段继续裂解（表现为水解度继续升高），丧失已有的α-葡萄糖苷酶抑制活性，降低酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率。因此，选定16000 U/g作为最适酶添加量进行后续实验。 

图  3酶添加量对水解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率与水解度的影响

Figure  3.Effect of enzyme addition amount on α-glucosidase inhibition rate and degree of hydrolysis of enzymatic products

2.2.3   底物浓度对樟树籽仁蛋白酶解产物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

由图4可知，随着底物浓度增大，樟树籽仁蛋白酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率呈现先升高后下降的趋势。底物浓度达到2%，樟树籽仁蛋白酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值43.23%，底物浓度继续增大导致α-葡萄糖苷酶抑制率下降。这可能是由于底物蛋白浓度的增加影响了酶水解系统的流动性以及蛋白酶与底物之间接触表面的大小，在相同的酶解时间内，肽键断裂的速度下降，不能使酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率继续升高。对于水解度而言，樟树籽仁蛋白酶解产物的水解度随着底物浓度增大而不断降低。这一现象可能是由底物浓度过高，酶解不完全导致的。基于α-葡萄糖苷酶抑制活性为本研究的主要评价指标，因此选定2%作为最佳底物浓度进行后续实验。

图  4底物浓度对酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率与水解度的影响

Figure  4.Effect of substrate concentration on α-glucosidase inhibition rate and degree of hydrolysis of enzymatic product

2.2.4   酶解pH对樟树籽仁蛋白酶解产物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

如图5所示，pH在4.0~6.0范围内时，樟树籽仁蛋白酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度总体表现出先升高后降低的趋势。其中，在pH为4.0~5.5时，樟树籽仁蛋白酶解产物的整体抑制效果随酸性的减弱而逐步增强；在pH为5.5时，樟树籽仁蛋白酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度达到最大值分别为46.34%和25.08%。继续增大酶解pH从5.5至6.0，樟树籽仁蛋白酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度分别降低至42.81%和20.73%。这种现象的原因可能是偏酸或偏碱环境会在一定程度上破坏蛋白酶的结构稳定性，抑制蛋白酶的催化活性，从而导致酶解产物的水解度和抑制率降低。因此，选定pH5.5为最佳酶解pH进行后续实验。

图  5酶解pH对酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率与水解度的影响

Figure  5.Effect of enzymatic hydrolysis pH on α-glucosidase inhibition rate and degree of hydrolysis of enzymatic products

2.2.5   酶解时间对樟树籽仁蛋白酶解产物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影响

如图6所示，在酶解2.0 h时，樟树籽仁蛋白酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值为47.81%，此时水解度为24.26%。当继续延长酶解时间至3.0 h，樟树籽仁蛋白酶解产物的水解度略有增加，α-葡萄糖苷酶抑制率略有下降，但无显著性变化（P>0.05）。这一现象的原因可能是随着酶解时间的延长，可被酶解的樟树籽仁蛋白的酶解位点数量减少，前期部分已被水解的蛋白肽可能被进一步水解成无α-葡萄糖苷酶抑制率的氨基酸片段，导致酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率下降。因此，选择2.0 h为最佳酶解时间进行后续实验。

图  6酶解时间对酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制率与水解度的影响

Figure  6.Effect of enzymatic hydrolysis time on α-glucosidase inhibition rate and degree of hydrolysis of enzymatic products

2.3   正交试验结果分析

根据单因素实验结果，对酶解温度、酶解pH、酶解时间、酶添加量进行L9（34）正交试验。由表3极差R大小可见，四种因素对樟树籽仁蛋白酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制率的效果影响依次为：酶解温度>酶解时间>酶添加量>酶解pH。结果表明，樟树籽仁蛋白最佳酶解工艺条件的组合为A2B2C3D2，即酶解温度为55 ℃、酶添加量为16000 U/g、酶解pH为6.0、酶解时间为2.0 h。在最佳工艺条件下，进行3次平行实验，得到樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽（10 mg/mL）的α-葡萄糖苷酶抑制率为48.81%，高于正交试验组的最大值；在樟树籽仁蛋白酶解产物浓度为0~20 mg/mL时，验证其IC50值为11.52 mg/mL。

表  3正交试验结果

Table  3.Orthogonal test results

2.4   樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸组成

多肽的生物活性与氨基酸组成直接相关。如表4所示，从樟树籽仁蛋白及其α-葡萄糖苷酶抑制肽中共检测出17种氨基酸，包括8种必需氨基酸和9种非必需氨基酸。樟树籽仁蛋白及其α-葡萄糖苷酶抑制肽的总氨基酸含量分别为80.82 g/100 g和71.49 g/100 g，与蛋白质含量（分别为90.80%和84.09%）的结果一致，表明樟树籽仁蛋白及其α-葡萄糖苷酶抑制肽中不仅含有蛋白质，还可能含有糖类。樟树籽仁蛋白酶解产物中疏水性氨基酸（丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸）含量占总氨基酸含量的30.06%，显著高于樟树籽仁蛋白的疏水性氨基酸含量26.89%（P<0.05）。研究表明，多肽中疏水性氨基酸的含量与其α-葡萄糖苷酶抑制活性呈正相关。因此，可通过进一步从樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽中富集纯化含有疏水性氨基酸的多肽，提高其α-葡萄糖苷酶抑制能力。 

表  4樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸组成

Table  4.Amino acid composition of α-glucosidase inhibitory peptides derived from Cinnamomum camphora seed kernel protein

注：同行不同字母代表组间存在显著性差异（P<0.05）。

2.5   DPPH自由基清除能力

研究表明，氧化应激是2型糖尿病的重要诱因之一。在糖尿病的发生发展过程中，慢性高血糖持续促进活性氧（ROS）的产生并引发氧化应激，从而加剧了胰岛素抵抗，导致糖尿病持续进展和恶化。因此，有必要对樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的抗氧化能力进行评价。DPPH自由基清除能力可以反映食品来源生物活性物质的抗氧化特性。如图7所示，樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的DPPH自由基清除能力随着样品浓度的增加而增加。在测定浓度范围内（2~10 mg/mL），樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的DPPH自由基清除率由15.93%增加至78.56%。当样品浓度达到10 mg/mL时，其DPPH自由基清除率达到最大值为78.56%，其IC50值为5.42 mg/mL。

图  7樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的DPPH自由基清除能力

Figure  7.DPPH radical scavenging ability of α-glucosidase inhibitory peptides derived from Cinnamomum camphora seed kernel protein

2.6   ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除率可以反映体系内包括亲水性和疏水性肽在内的总抗氧化活性。如图8所示，樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的ABTS+清除能力随着样品浓度的增加而增加。在测定浓度范围内（0.2~1.0 mg/mL），樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的ABTS+自由基清除率由28.37%增加至59.31%，其IC50值为0.64 mg/mL。综上，樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽具有良好的体外抗氧化活性。

图  8樟树籽仁蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的ABTS⁺自由基清除能力

Figure  8.ABTS⁺ radical scavenging ability of α-glucosidase inhibitory peptide derived from Cinnamomum camphora seed kernel protein

结论

通讯作者简介

鄢祥辉，系‌南昌大学资源与环境学院 2023 届博士毕业生‌，师从弓晓峰教授，后续在‌南昌大学食品学院‌及食品科学与资源挖掘全国重点实验室从事博士后研究工作，主要致力于樟树籽高值化利用与健康油脂研发 。

（以上信息来自于网络）