维生素是维持机体正常代谢所必需的微量元素，其在人体不能合成或合成量不足时必须从外界摄取。VB₅又称泛酸，是合成辅酶A（CoA）的前体，而CoA在脂肪酸代谢和柠檬酸循环中发挥着至关重要的作用。VB₅在人体内可作用于神经、肾上腺及皮肤等，提高人体免疫力，并且可增加谷胱甘肽的生物合成以减轻细胞氧化损伤和凋亡。VB₁₂又称钴胺素，根据配体基团不同可分为5’-脱氧腺苷钴胺素、甲基钴胺素、羟钴胺素和氰钴胺。在机体内能够直接合成具有活性的脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素，作为辅酶参与体内的各种代谢。而羟钴胺素是脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素的光解产物。氰钴胺具有较强的光稳定性，是VB₁₂常见的商品化存在形式。人体缺乏VB₁₂可导致同型半胱氨酸的积累，影响免疫稳态，从而导致动脉粥样硬化等疾病。此外，神经元容易受到VB₁₂缺乏以及同型半胱氨酸水平增加的损伤，其潜在机制可能与氧化应激增强和甲基化程度降低有关。有研究表明，在帕金森病（PD）患者的饮食中补充VB₁₂可降低其同型半胱氨酸水平，缓解PD患者的症状。

PD是世界第二大神经退行性疾病，其病理特征是中脑黑质部多巴胺能神经元变性丢失，残存的神经元内形成以α-突触核蛋白为主要成分的路易小体。多巴胺能神经元的丢失导致纹状体多巴胺水平降低，从而出现一系列临床症状，其表现为运动迟缓、静止性震颤、肌肉强直及姿势步态失衡等运动障碍以及抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状。关于PD的发病机制至今仍未明确。大量研究表明，PD的发生发展可能与老化、环境毒素、遗传因素等密切相关。此外，神经炎症、氧化应激、内质网应激（ERS）、免疫炎症、线粒体功能障碍等机制也参与了PD的发生和发展。

基于B族维生素在神经方面的保护作用，南昌大学食品学院食品科学与资源挖掘全国重点实验室的陈雅如、阮雅婕和关倩倩*等人以生物合成的VB₅及VB₁₂为研究对象，构建1-甲基-4-苯基-吡啶离子（MPP⁺）诱导的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）PD模型，旨在探究生物合成VB₅及VB₁₂在神经保护方面的作用及其机制，为VB₅和VB₁₂在PD治疗中的应用提供理论依据。

1 MPP⁺造模浓度及VB₅与VB₁₂的安全浓度确定

通过CCK-8法检测MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞活力。如图1A所示，与对照组相比，MPP⁺处理24 h或48 h后，细胞存活率呈现浓度依赖性下降，处理24 h和48 h组的IC₅₀分别为2 mmol/L和0.1 mmol/L。为缩短实验周期，后续实验选用2 mmol/L的MPP⁺处理24 h构建细胞模型。如图1B、C所示，当VB₅或VB₁₂浓度≥200 μmol/L时，细胞活力呈逐渐下降趋势，尤其当VB₅或VB₁₂浓度为400 μmol/L，对细胞活力的抑制作用更为明显；而浓度在1～100 μmol/L时，细胞存活率基本上无显著变化，故确定1～100 μmol/L为二者处理24 h的MNTC范围。基于此，选取1、5、10、50 μmol/L和100 μmol/L进行后续保护性实验。

2 VB₅及VB₁₂对MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞存活率的影响

如图2A所示，与对照组相比，MPP⁺组细胞存活率显著下降（P＜0.05），而VB₅干预可显著提高MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞存活率（P＜0.05），其中5 μmol/L VB₅的改善效果最佳，因此选用此浓度进行后续实验。如图2B所示，不同浓度的VB₁₂处理均能显著提升MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞存活率（P＜0.05），且10 μmol/L VB₁₂的改善效果最佳。由于VB复合使用时通常会产生协同作用，因此为进一步探究VB₅及VB₁₂联合使用对MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响，选用5 μmol/L VB₅与5、10、50 μmol/L VB₁₂分别进行复配。如图2C所示，随着VB₁₂浓度的升高，SH-SY5Y细胞存活率呈剂量依赖性增加，其中5 μmol/L VB₅+50 μmol/L VB₁₂联合处理时，SHSY5Y细胞存活率最高。综上，后续机制实验选用5 μmol/L VB₅、10 μmol/L VB₁₂及5 μmol/L VB₅+50 μmol/L VB₁₂处理细胞。

3 VB₅及VB₁₂对MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响

4 VB₅及VB₁₂改善MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞线粒体功能障碍

由于线粒体在进行氧化磷酸化的过程中伴随着电子传递，本身会产生大量的自由基。在线粒体发生功能障碍时，其对自由基的清除能力减弱，使其受到过多自由基的损伤。基于这一生物学功能使线粒体成为细胞内ROS主要来源。采用DCFH-DA作为荧光探针检测细胞ROS水平，结果如图4C、D所示。MPP⁺组的平均荧光强度显著高于正常对照组（P＜0.05），而VB₅、VB₁₂单独或联合处理均可显著降低平均荧光强度（P＜0.05），且联合使用效果更显著，提示二者可抑制MPP⁺诱导的ROS过度生成。

线粒体的基本生物功能是参与氧化磷酸化的过程中合成细胞所需的ATP，因此进一步检测了线粒体功能的关键指标ATP含量，结果如图4E所示。与正常对照组相比，MPP⁺组的细胞ATP含量显著降低（P＜0.05）；VB₅、VB₁₂单独或联合处理可显著提升ATP含量（P＜0.05），且联合处理的提升效果更显著，表明二者可改善MPP⁺导致的能量代谢失调。

此外，线粒体是细胞凋亡的调控中心，Cyt-c从线粒体中释放，其表达量升高是细胞凋亡的关键反映指标。为了进一步揭示VB₅及VB₁₂对MPP⁺诱导细胞损伤的保护作用机制，采用Western Blot检测与线粒体相关的死亡信号Cyt-c蛋白表达水平，同时采用PCR检测Cyt-c基因表达水平。如图4F、G所示，MPP⁺处理显著上调了SH-SY5Y细胞的Cyt-c蛋白表达水平（P＜0.05），VB₅、VB₁₂单独或联合处理可显著下调其表达水平（P＜0.05）。如图4H所示，MPP⁺组中Cyt-c的mRNA表达水平显著上调（P＜0.05），而VB₅、VB₁₂单独或联合处理均可显著下调MPP⁺诱导的Cyt-c mRNA表达水平升高。

综上，VB₅及VB₁₂通过恢复线粒体膜电位、提高ATP含量、降低ROS水平及抑制Cyt-c的释放等方式改善MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞的线粒体功能损伤。

5 VB₅及VB₁₂改善MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞的ERS

为了进一步探究VB₅及VB₁₂是否能通过ERS缓解MPP⁺诱导的细胞损伤，采用Western Blot检测ERS相关蛋白Bip及CHOP表达水平。其中Bip为内质网分子伴侣，在正常细胞状态下表达水平低，当细胞处于ERS时，Bip会与内质网上3种跨膜感受蛋白解离，而当细胞处于长时间或严重的ERS时，Bip及CHOP表达量上升。如图5A～C所示，与正常对照组相比，MPP⁺组中的Bip和CHOP蛋白相对表达水平显著增加（P＜0.05）；而VB₅、VB₁₂单独或联合处理均可显著下调二者的表达水平（P＜0.05）。

细胞可以通过未折叠蛋白反应（UPR）介导的3条信号通路缓解ERS，其中蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）通路被激活时，可能涉及Bip、PERK、eIF2α、ATF4及CHOP的mRNA表达水平变化。如图5D～H所示，与正常对照组比较，MPP⁺组中Bip、PERK、eIF2α、ATF4及CHOP的mRNA相对表达量显著上调（P＜0.05），VB₅、VB₁₂单独干预或联合处理可显著下调上述基因的mRNA相对表达量（P＜0.05）。

上述结果显示，VB₅与VB₁₂可通过抑制PERK-真核生物起始因子2α（eIF2α）-激活转录因子4（ATF4）-CHOP信号通路的激活，缓解MPP⁺诱导的ERS。

6 讨 论

近年来，越来越多的研究表明VB₅与VB₁₂在神经退行性疾病的防治中具有潜力。VB₅是CoA的前体，参与中枢神经系统的能量代谢、神经递质合成及髓鞘形成。VB₅缺乏会影响脑内CoA的合成，进而损害神经功能。VB₁₂在脂肪酸和氨基酸代谢及核苷酸合成中发挥着关键作用，尽管其与神经功能障碍的关联已得到广泛认可，但其具体作用机制仍需进一步阐明。本研究发现，VB₅及VB₁₂可显著提升MPP⁺损伤的SH-SY5Y细胞活力，证实二者具有一定的神经保护作用。

线粒体功能异常是PD发病的核心机制之一。线粒体作为细胞的“能量工厂”，通过三羧酸循环与氧化磷酸化生成ATP，同时也是胞内ROS的主要来源。当线粒体功能受损时，线粒体膜电位下降，ROS水平增加，ATP合成减少，同时线粒体通透性转换孔开放，导致Cyt-c释放到胞质，激活Caspase级联反应，最终诱发细胞凋亡。本研究中，MPP⁺处理导致SH-SY5Y细胞的线粒体膜电位降低、ROS过量生成、ATP含量减少、Cyt-c释放增加及Caspase-3激活，而VB₅与VB₁₂可逆转上述变化，提示二者可能通过保护线粒体功能发挥神经保护作用。

细胞凋亡的调控涉及多种信号通路，其中Bcl-2家族蛋白是线粒体凋亡通路的关键调控因子。Bcl-2作为抗凋亡蛋白，可通过抑制线粒体Cyt-c释放阻断凋亡进程；而Bax作为促凋亡蛋白，可促进线粒体膜通透性增加，加速细胞凋亡。本研究结果表明，MPP⁺处理会上调细胞的Bax表达、下调Bcl-2表达，而VB₅与VB₁₂可逆转这一趋势，进一步证实二者可通过调控Bcl-2家族蛋白表达抑制细胞凋亡。

ERS也是PD发病的重要机制。内质网是蛋白质折叠与加工的主要场所，当外源性或内源性因素导致内质网中错误折叠蛋白蓄积时，会触发UPR。UPR通过PERK、肌醇需求酶1（IRE1）、激活转录因子6（ATF6）3条信号通路调节蛋白折叠，若应激持续或损伤严重，UPR会启动凋亡程序，其中CHOP是ERs介导凋亡的关键因子。目前认为ERS可能通过CHOP途径诱导调亡。本研究中，MPP⁺处理导致Bip、CHOP表达上调，PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路激活，而VB₅与VB₁₂可抑制上述变化，表明缓解ERS是二者发挥神经保护作用的另一重要机制。

VB₅及VB₁₂发挥神经保护作用的可能机制如图6所示。VB₅与VB₁₂抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路缓解ERS，同时调节Bcl-2/Bax表达、恢复线粒体功能，最终抑制MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。从作用机制的协同性来看，VB₅作为CoA的前体，可通过促进线粒体底物酰化与能量代谢，协同增加谷胱甘肽合成，从而提高线粒体膜电位、ATP含量及降低ROS水平。VB₁₂则通过调节同型半胱氨酸代谢与甲基化反应，影响蛋白折叠与UPR，在下调Bip、CHOP表达方面表现更突出。二者联合使用时，在线粒体膜电位恢复、ATP合成、Cyt-c水平抑制及Bcl-2/Bax调节等方面表现出累加效应，同时对PERKeIF2α-ATF4-CHOP通路的抑制作用强于单药处理，进一步证实二者具有协同保护作用。

7 结 论