IF:23.6《BAM》南昌大学万文兵/易阳艳:细菌微环境响应型＂导弹＂微针调控免疫并穿透生物膜加速糖尿病创面愈合

针对上述问题，南昌大学第二附属医院万文兵教授联合易阳艳教授团队构建了一种细菌微环境响应型双层"导弹"微针系统（DAg/HTMS-MNs），以透明质酸（HA）为基质，上层负载葡聚糖修饰银纳米粒子（Dex/Ag NPs）实现深层抗菌与生物膜靶向，下层负载肝素包覆的牛磺酸微球（HP-Taurine@MS）执行"全局减压-局部增强"免疫调控策略。该系统通过气体推进增强穿透、细菌透明质酸酶触发智能释药、肝素螯合MCP-1并招募巨噬细胞、牛磺酸持续释放重编程M2表型，实现了抗菌-抗炎-促修复的时空协同。该文章于2025年9月27日以《Bacteria microenvironment-responsive missile microneedles modulate immunity and penetrate biofilm for diabetic wound therapy》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI: 10.1016/j.bioactmat.2025.09.017）。

图1. DAg/HTMS-MNs的合成结构示意图

（1）Dex/Ag NPs的合成与表征

采用NaBH₄还原法合成柠檬酸封端银纳米粒子，TEM显示其呈均匀球形（图2A）。EDS分析证实Dex/Ag NPs表面出现氮元素信号，归因于葡聚糖锚定。DLS显示Ag NPs平均粒径20.92 nm，葡聚糖修饰后增至32.06 nm；Zeta电位由−21.16±1.46 mV变为−11.39±0.96 mV（图2C、D）。XPS在368.2 eV处检测到Ag特征双峰，FTIR在2920 cm⁻¹处出现C-H键伸缩振动峰（图2E、F）。3D CLSM显示Cy5.5标记的Dex/Ag NPs在金黄色葡萄球菌生物膜中保留量显著高于未修饰Ag NPs，Pearson相关系数达0.76（vs. 0.38），伴随生物膜结构疏松（图2B、S1A-B、S2A-B）。SEM显示Dex/Ag NPs组细菌表面纳米粒子附着密度更高（黄色箭头），包膜损伤更广泛（红色箭头）（图2G）。生长曲线显示Dex/Ag NPs仅需40 μg/mL即可完全抑制细菌可见生长，而Ag NPs需80 μg/mL（图2H）。

图2. Dex/Ag NPs的表征与生物膜靶向性能。（a）Ag NPs与Dex/Ag NPs的TEM图像及EDS元素mapping图；（b）Cy5.5标记Dex/Ag NPs处理60 min后金黄色葡萄球菌生物膜的3D CLSM图像及对应z-stack图像（绿色：活菌，红色：Cy5.5标记纳米粒子）；（c）Ag NPs与Dex/Ag NPs的DLS粒径数据；（d）Ag NPs与Dex/Ag NPs的Zeta电位；（e）Ag NPs与Dex/Ag NPs的XPS全谱扫描；（f）Ag NPs与Dex/Ag NPs的FTIR光谱；（g）Ag NPs与Dex/Ag NPs分别与浮游金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共培养后的SEM形貌；（h）不同浓度Ag NPs与Dex/Ag NPs与金黄色葡萄球菌共培养后的生长曲线。

（2）HP-Taurine@MS微球的合成与表征

HP-Taurine@MS通过乳液溶剂挥发法制备，SEM显示MS微球具有明确多孔结构，载牛磺素及肝素钠功能化后孔径与密度逐渐减小，但HP-Taurine@MS保持结构孔隙率（图3B）。DLS显示水动力学直径呈梯度递增：MS（79.93 μm）→ Taurine@MS（101 μm）→ HP-Taurine@MS（119.81 μm）。XPS检测到Taurine@MS出现硫（S）峰，HP-Taurine@MS出现硫峰及氮（N）峰；FTIR中Taurine@MS的1121 cm⁻¹峰变化与牛磺酸S-O伸缩振动相关，HP-Taurine@MS的1651 cm⁻¹峰变化归因于酰胺键形成，1230 cm⁻¹峰与肝素钠磺酸基团相关。MCP-1结合动力学显示HP-Taurine@MS在24 h内捕获大部分趋化因子（图3C）。LPS激活巨噬细胞条件培养基与HP-Taurine@MS共孵育3天，MCP-1水平逐渐下降（图3D）。直接共培养实验显示HP-Taurine@MS周围形成独特的放射状细胞聚集结构，荧光信号强度及细胞共定位显著优于其他组（图3E、G、I）；Transwell迁移实验证实其细胞招募效率显著更高（图3F、H）。

图3. HP-Taurine@MS结合趋化因子并招募炎症单核/巨噬细胞。（a）HP-Taurine@MS结合趋化因子并吸引炎症单核/巨噬细胞示意图；（b）MS、Taurine@MS、HP-Taurine@MS的TEM图像；（c）HP-Taurine@MS在不同时间点的MCP-1结合效率；（d）巨噬细胞条件培养基与MS、Taurine@MS、HP-Taurine@MS共孵育3天后的MCP-1浓度变化（每日更换微球）；（e）MCP-1富集环境招募单核细胞，活/死细胞染色试剂标记单核细胞（绿色），黄色箭头指示MS、Taurine@MS及HP-Taurine@MS；（f、h）L929细胞Transwell迁移的明场图像及定量结果（n=3）；（g）依据e图的巨噬细胞黏附微球表面相对荧光定量分析；（i）微球-巨噬细胞荧光共定位曲线。

（3）DAg/HTMS-MN贴片的制备与表征

采用"先尖端后基部"两步浇注法，将Dex/Ag NPs整合上层与HP-Taurine@MS装载下层组装为双层微针贴片。光学照片显示10×10阵列构型（图4A）。SEM显示圆锥形微针高度约600 μm、底径约200 μm；高倍顶视图显示上层因Dex/Ag NPs掺入呈粗糙表面（红色箭头），下层半球形突起（黄色箭头）证实微球成功装载（图4B、C）。荧光显微镜（绿色：Dex/Ag NPs，红色：微球）从侧视与顶视确认绿色发射的Dex/Ag NPs位于上层、红色发射微球位于下层的双相结构（图4D、E）。力学测试显示每根微针最大承受力0.6 N，远超皮肤穿透所需0.1 N（图4F）。大鼠背部皮肤应用后可见10×10微孔阵列，针体完全嵌入；组织学横切面确认穿透表皮与真皮层（图4G）。药物释放研究显示：HA基质快速释放Dex/Ag NPs，PLGA微球持续释放牛磺酸；透明质酸酶处理显著加速银离子释放，证实感染特异性酶响应按需释药能力（图4H）。L929细胞活/死染色及相对生长率显示所有微针制剂无不良反应，RGR均>80%，符合ISO 10993.5-2009标准（图4I、J）。15天主要器官（心、肝、脾、肺、肾）H&E染色未见病理改变，凝血指标（PT、APTT）无显著异常。

图4. DAg/HTMS-MNs的制备与表征。（a）DAg/HTMS-MNs代表性照片；（b）DAg/HTMS-MNs顶视与侧视SEM图像；（c）微针顶视及上、下半部分放大SEM图像；（d）DAg/HTMS-MNs侧视及其双层结构荧光图像；（e）DAg/HTMS-MNs顶视及其双层结构荧光图像；（f）DAg/HTMS-MNs机械强度；（g）DAg/HTMS-MNs应用于小鼠皮肤后的代表性图像及穿透小鼠背部皮肤的局部HE染色切片；h）DAg/HTMS-MNs中Ag NPs与牛磺酸的累积释放曲线；（i）L929细胞经MNs、DAg-MNs、HTMS-MNs及DAg/HTMS-MNs提取液处理1天和3天后的活/死染色；（j）L929细胞经MNs、DAg-MNs、HTMS-MNs及DAg/HTMS-MNs提取液处理1、3、5天后的相对生长率。

（4）气体推进穿透与体外抗菌性能

PBS中DAg/HTMS-MNs下层快速产生气泡，而MNs组无明显变化（图5B）。时序成像显示气泡逐渐积累，最终产生足够升力使针尖向上推进（图5C）。5 min内CO₂总产量约1.31±0.04 mL，产气速率0.26±0.01 mL/min。琼脂糖模型中，DAg/HTMS-MNs组染料穿透深度显著增加；0-500 μm深度各组分布相似，但超过500 μm后，750 μm与1000 μm处平均荧光强度显著高于MNs组（图5D、E）。皮肤模型冷冻切片显示无气体推进MNs穿透深度451±56.7 μm，显著低于DAg/HTMS-MNs的662±53.7 μm。

活/死染色显示DAg/HTMS-MNs组生物膜中红色荧光最强、绿色信号最少，抗菌效果最优（图5I）。SEM显示该组细菌密度显著降低、生物膜结构完全崩解、出现特征性凹陷/破裂（图5H）。菌落计数显示：针对金黄色葡萄球菌，DAg-MNs与DAg/HTMS-MNs组细菌存活率分别降至10.87±1.89%和4.23±0.70%，约为对照组（100±4.56%）、MNs组（99.16±5.96%）及HTMS-MNs组（99.52±0.54%）的1/10；大肠杆菌实验趋势一致，存活率分别降至5.81±1.92%和0.57±0.17%（图5F、G）。结晶紫染色显示DAg/HTMS-MNs仅残留碎片状生物膜，定量分析证实其分散成熟生物膜能力最优（图5J、K）。

图5. 气体推进微针穿透与抗生物膜性能。（a）导弹仿生微针示意图；（b）PBS中DAg-HTMS MNs气泡生成过程的显微图像；（c）PBS中DAg-HTMS MNs针尖气体驱动推进的时序演示；（d）不同微针释放荧光素钠穿透深度的共聚焦显微成像；（e）不同微针在不同深度释放荧光素钠的荧光强度定量分析（双侧t检验）；（f）不同微针组处理后金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的代表性菌落照片；（g）菌落计数法测定金黄色葡萄球菌与大肠杆菌细菌活力的定量分析；（h）不同微针组处理后金黄色葡萄球菌与大肠杆菌生物膜的SEM图像；（i）不同微针处理后金黄色葡萄球菌与大肠杆菌生物膜的3D CLSM图像（绿色：活菌，红色：死菌）；（j）不同微针处理后金黄色葡萄球菌与大肠杆菌生物膜的结晶紫染色照片；（k）结晶紫染色生物膜的定量分析。

（5）体外ROS清除与免疫调节能力

H₂O₂预处理的Raw264.7细胞经HTMS-MNs与DAg/HTMS-MNs提取液处理后，ROS表达显著降低（图6A）。JC-1检测显示H₂O₂诱导的线粒体去极化在HTMS-MNs与DAg/HTMS-MNs组得到恢复，聚集/单体比值显著高于其他组（图6B、C）。ELISA显示牛磺酸单独促进巨噬细胞向M2表型极化。CD206（M2标志物）与iNOS（M1标志物）荧光染色及热图显示，HTMS-MNs与DAg/HTMS-MNs提取液促进巨噬细胞从促炎状态向促再生表型转化（图6D、G），IL-10表达增加、TNF-α表达受抑。与金黄色葡萄球菌共培养时，HTMS-MNs与DAg/HTMS-MNs提取液显著增强巨噬细胞细菌吞噬能力（图6E、F），并改善胞内杀菌能力。

图6. DAg/HTMS-MNs的体外ROS清除与免疫调节能力。（a）H₂O₂激活巨噬细胞经PBS、MNs、HTMS-MNs、DAg-MNs及DAg/HTMS-MNs处理24 h后的mtROS染色（完全培养基孵育细胞为对照）；（b）PBS、MNs、HTMS-MNs、DAg-MNs、DAg/HTMS-MNs提取液及对照组处理巨噬细胞的JC-1荧光图像；（c）JC-1红/绿荧光强度比值；（d）PBS、MNs、HTMS-MNs、DAg-MNs、DAg/HTMS-MNs及对照组对LPS预处理Raw264.7细胞极化的iNOS与CD206荧光图像；（e）巨噬细胞吞噬细菌的典型图像（绿色：金黄色葡萄球菌，红色：巨噬细胞，蓝色：细胞核）；（f）吞噬细菌的荧光定量分析；（g）iNOS与CD206相对表达水平的热图。

（6）体外细胞迁移与血管生成评价

划痕实验中，HTMS-MNs与DAg/HTMS-MNs组在24、48、72 h后划痕面积显著小于对照组、MNs组及DAg-MNs组（图7A、B）。Transwell迁移实验显示该两组迁移细胞数量与密度显著更高（图7C、D）。管腔形成实验显示分支点数量更多（图7E、F）。CD31免疫荧光显示HTMS-MNs与DAg/HTMS-MNs组荧光强度显著增强（图7G、H）。

图7. 体外细胞迁移与血管生成评价。（a）收集微针提取液与巨噬细胞共培养上清后，再与HUVECs共培养的划痕实验代表性图像；（b）划痕闭合率（残余创面面积，%）定量分析；（c）收集微针提取液与巨噬细胞共培养上清后HUVECs Transwell迁移实验的代表性图像；（d）迁移实验中迁移细胞的定量分析；（e）收集微针提取液与巨噬细胞共培养上清后HUVECs管腔形成实验的代表性图像；（f）管腔形成测试中分支点（mm²）的定量分析；（g）收集微针提取液与巨噬细胞共培养上清后HUVECs CD31免疫荧光染色实验的代表性图像；（h）CD31相对荧光强度的定量分析。*p < 0.001，**p < 0.0001。

（7）体内糖尿病感染创面愈合

糖尿病感染创面模型中，DAg/HTMS-MNs组第5天细菌菌落数显著少于对照组、MNs组及HTMS-MNs组，细菌存活率分别为21±6.2%（DAg-MNs）和8.15±1.73%（DAg/HTMS-MNs）（图8D）。Giemsa染色一致显示DAg/HTMS-MNs组细菌负荷最低（图8F、I）。创面面积曲线显示DAg/HTMS-MNs组在各时间点收缩最快，15天内接近完全闭合（图8B、C、H）。第10天H&E显示DAg/HTMS-MNs组创面宽度显著减小，再上皮化率（84±7%）远超对照组（45.36±16.1%）、MNs组（60.3±14.3%）、HTMS-MNs组（72.3±6.3%）及DAg-MNs组（73.3±6.3%）（图8E、J）。第15天Masson三色染色显示胶原纤维沉积显著增强，组织结构良好（图8G、K）。新生组织出现近似正常皮肤形态的毛囊结构。

图8. 体内糖尿病感染创面愈合评价。（a）糖尿病感染小鼠创面模型构建及微针治疗过程示意图；（b）不同处理后不同时间点小鼠创面图像；（c）不同处理后不同时间点感染创面模拟图像；（d）第5天不同组创面分泌物感染细菌菌落的代表性照片；（e）第10天不同组创面H&E染色代表性图像；（f）第5天不同组创面Giemsa染色代表性图像；（g）第15天不同组创面Masson三色染色代表性图像；（h）不同时间点创面面积的定量分析；（i）Giemsa染色细菌计数的定量分析；（j）依据H&E染色的再上皮化率定量；（k）依据g图的各组创面胶原沉积定量。p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001。

（8）转录组测序揭示分子机制

RNA-seq PCA显示两组基因表达谱显著分离（图9A）。DAg/HTMS-MNs组 vs 对照组共发现704个上调基因（201个显著上调）和1053个下调基因（530个显著下调）（图9B）。前20个差异表达基因热图显示清晰聚类（图9C）。GO分析显示上调基因富集于氧化还原酶活性、细胞迁移正调控、胶原细胞外基质组织等创面修复相关过程；下调基因涉及免疫应答、Toll样受体信号通路、LPS细胞应答、NF-κB转录因子活性正调控等炎症与氧化应激相关通路（图9D、E）。KEGG分析显示AMPK信号通路、ECM-受体相互作用、PPAR信号通路等创面愈合相关通路上调；IL-17信号通路、NOD样受体信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路等M1巨噬细胞激活相关通路显著下调（图9F、G）。关键炎症介质（Ccl2、Ccl11、Defb3、Tnfrsf1b、IL6）及蛋白水解因子（Mmp9、Mmp19）均显著下调。

图9. DAg/HTMS-MNs促进糖尿病感染创面愈合的转录组测序分析。（a）所有样本关系的2D PCA图；（b）DAg/HTMS-MNs组与对照组火山图（红色：上调基因，蓝色：下调基因）；（c）DAg/HTMS-MNs与Ctrl组差异基因热图（红色：上调基因，蓝色：下调基因）；（d）上调GO功能富集分析；（e）下调GO功能富集分析；（f）上调与下调KEGG功能富集分析；（g）KEGG富集术语及其对应富集和弦图。

（9）体内炎症调控效应

免疫荧光显示DAg/HTMS-MNs处理10天后，创面中心区域促炎M1标志物iNOS表达显著降低，抗炎M2标志物CD206表达显著升高（图10A、B）。第10天M1/M2比值降至1以下，流式细胞术定量显示HTMS-MNs组（0.41±0.01）、DAg-MNs组（0.42±0.02）显著低于对照组（1.08±0.02）与MNs组（1.06±0.04），DAg/HTMS-MNs组最低（0.14±0.01）（图10E、F）。CD31免疫荧光显示DAg/HTMS-MNs组新生血管形成显著增强，平均荧光强度2.17±0.05（图10C、D）。

免疫组化显示DAg/HTMS-MNs组IL-17、IL-6、TNF-α表达显著降低，IL-10表达显著升高（图11A-H）。qPCR证实该组促炎因子（TNF-α、IL-1β）显著下调，抗炎标志物（CD206、IL-10）显著上调（图11I）。结合转录组结果，证实DAg/HTMS-MNs通过下调IL-17信号通路促进糖尿病慢性创面愈合。

图10. DAg/HTMS-MNs的体内炎症调控效应。（a）治疗10天后对照组、MNs组、DAg-MNs组、HTMS-MNs组及DAg/HTMS-MNs组创面中心区域iNOS与CD206表达；（b）iNOS相对荧光定量、CD206相对荧光定量及M1/M2荧光强度比值；（d）治疗10天后各组创面中心区域CD31表达；（e）M1（iNOS）与M2（CD206）巨噬细胞群体门控策略的代表性流式细胞术图；（f）iNOS与CD206表达的流式细胞术分析及M1/M2比值统计评价。

图11. DAg/HTMS-MNs调控创面炎症因子表达。（a）治疗10天后各组创面中心区域IL-17免疫组化染色照片；（b）IL-17相对基因表达水平；（c）治疗10天后各组创面中心区域IL-6免疫组化染色照片；（d）IL-6相对基因表达水平；（e）治疗10天后各组创面中心区域TNF-α免疫组化染色照片；（f）TNF-α相对基因表达水平；（g）治疗10天后各组创面中心区域IL-10免疫组化染色照片；（h）IL-10相对基因表达水平；（i）处理后组织中抗炎与促炎细胞因子mRNA表达的qPCR分析（MN、HTMS-MNs、DAg-MNs或DAg/HTMS-MNs处理后的CD206、IL-10抗炎标志物及IL-1β、TNF-α促炎标志物mRNA水平）。

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