南昌大学|南昌大学第一附属医院:一种受钟乳石启发的近红外/pH 响应可可视化纳米平台,用于微环境激活治疗植体周围炎症引起的骨缺损

第一作者：Ziyu Zhou

图1. 近红外/pH响应型可视化纳米平台用于种植体周围炎诱导骨缺损的微环境激活治疗及其治疗应用的示意图说明。A) CIMA 制备过程的示意图。B) SD 大鼠种植体周围炎骨缺损模型的建立。C) CIMA 响应骨缺损微环境，通过释放制剂提供可视化早期预警（I），并在近红外照射下实现针对种植体周围炎的协同抗菌（IIa）和抗炎（IIb）治疗。D) 治疗前后骨缺损修复的示意图（III）。

图2. CIA 和 CIMA 的制备与表征。A) CIMA 制备过程的示意图。B) CIMA 的透射电子显微镜图像及元素分布图。C) CIA 和 CIMA 的 Zeta 电位测量结果。D) AZM、CI、CIA 和 CIMA 的傅里叶变换红外光谱图。E) 不同 pH 条件下 CIMA 的荧光光谱。F) CIM 和 CIMA 的 X 射线光电子能谱全谱图。G–I) CIMA 中 C 1s、P 2p 和 O 1s 的高分辨 XPS 谱图。J) 不同 pH 值下 CIMA 的紫外-可见光谱。K, L) 在 pH 4.5 和 pH 5.5 的缓冲溶液中，CIMA 随时间变化的紫外-可见光谱。数据以均值 ± 标准差表示（n ≥ 3）。

图3. 近红外响应性与活性氧调控。A) 在 808 nm 近红外光照射（1.0 W/cm²）下，CIA 和 CIMA 的温度变化。B) CIMA 加热 2 分钟后，经历三个开/关激光循环（30 秒开 / 30 秒关）的温度曲线。C) 在四次近红外激光开-关循环过程中 CIMA 的温度变化。D) CIMA 在近红外光照下产生¹O₂的示意图。E) 不同浓度 CIMA 处理后，DPBF 的紫外-可见光谱。F) CIMA 处理不同时间后，DPBF 的紫外-可见光谱。G) CIMA 清除·OH 机制的示意图。H) 近红外辐照下，不同浓度 CIMA 对·OH 的清除效率。I) CIA、CIMA 和 CIMA+NIR 组之间·OH 清除效率的比较。J) 不同 pH 缓冲液中，CIMA 吸附在羟基磷灰石（HAP）表面的荧光图像。K) 半定量荧光强度直方图。L) 不同孵育时间后，CIMA 吸附在 HAP 表面的代表性扫描电镜图像。数据以均值 ± 标准差表示（n ≥ 3）。**p < 0.01, ****p < 0.0001，ns 表示无显著性差异。

图4. CIA 和 CIMA 纳米颗粒的体外抗菌性能（NIR -：无近红外照射；NIR +：有近红外照射）。A) 不同处理后，金黄色葡萄球菌和变形链球菌的代表性菌落图像。B) 不同处理组的抗菌率。C) 金黄色葡萄球菌的扫描电镜图像（黄色：完整细菌；粉色：变形细菌）。D) 变形链球菌的扫描电镜图像（蓝色：完整细菌；粉色：变形细菌）。E) 细菌的活/死荧光染色图像（绿色：活菌；红色：死菌）。F) 基于活/死染色的细菌存活率半定量分析。G) 处理后单菌种生物膜的结晶紫染色图像。H) 生物膜清除率的半定量分析。数据以均值 ± 标准差表示（n ≥ 3）。**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，ns：无显著性差异。

图5. CIA 和 CIMA 对 RAW 264.7 巨噬细胞的 ROS 调控与免疫调节作用。A) 近红外照射下，与不同样品共培养后的 DPBF 荧光染色图。B) DCFH-DA 染色显示 LPS 刺激及不同处理后，细胞内的 ROS 水平。C) LPS 预处理后的 RAW 264.7 细胞中，M1 型标志物（CD86）和 M2 型标志物（CD206）表达的流式细胞术分析。D) 不同处理后，CD86（M1）和 CD206（M2）表达的代表性免疫荧光图像。E–H) CD86⁺ 和 CD206⁺ 巨噬细胞的定量流式细胞术结果。I–L) LPS 刺激及不同处理后，IL-6 和 TNF-α 分泌的 ELISA 分析结果。数据以均值 ± 标准差表示（n ≥ 3）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。

图6. CIA 和 CIMA 纳米颗粒对 MC3T3-E1 细胞粘附/成骨分化及破骨细胞诱导的影响（NIR -：无近红外照射；NIR +：有近红外照射）。A) 与 MC3T3-E1 细胞共培养 7 天后的碱性磷酸酶（ALP）染色。B) 共培养 24 小时后 MC3T3-E1 细胞的细胞骨架染色。C) 共培养 21 天后矿化结节的茜素红 S 染色。D–G) 不同时间点成骨基因（RUNX-2、BMP-2、COL-1、OCN）的 qRT-PCR 分析。H) 破骨细胞诱导的示意流程图以及牛皮质骨切片上多核破骨细胞的扫描电镜图像。I) 不同组中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性细胞的定量分析。J) 骨切片上成熟破骨细胞和吸收陷窝的扫描电镜图像。K) 共聚焦荧光图像显示，在与破骨细胞共培养的 CIA 或 CIMA 修饰的骨表面上出现近红外范围的信号，表明在骨吸收过程中发生了 pH 响应性荧光激活。数据以均值 ± 标准差表示（n ≥ 3）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，ns：无显著性差异。

图7. CIMA 纳米颗粒在大鼠种植体周围炎模型的种植体周围牙槽骨中的治疗效果。A) 体内实验的示意时间线，包括模型建立、给药和样本采集。B) 各组种植体及周围上颌牙槽骨的显微 CT 图像。C) 治疗 4 周后，骨体积分数（BV/TV）、骨表面积与骨体积比（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.Sp）的定量分析。D) 大鼠种植体周围牙槽骨的 H&E 染色。E) 种植体周围组织的马松三色染色，显示胶原沉积情况。F) 未脱钙的种植体周围骨组织的亚甲基蓝/酸性品红染色，显示骨-种植体直接接触。G) 各组种植体体内抗菌评价的代表性琼脂平板图像。H) 取出种植体的菌落计数统计。I) 不同时间点种植体周围炎大鼠的近红外活体荧光成像。J) 荧光强度/面积的半定量分析。数据以均值 ± 标准差表示（n ≥ 3）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，ns：无显著性差异。

图8. CIMA 纳米颗粒的体内抗炎和成骨分子机制。A) 种植体周围牙槽骨组织 RNA 测序的示意图。B) 差异表达基因的火山图，显示上调和下调的基因。C) 转录组学谱的主成分分析。D) 差异表达基因的基因本体论富集分析。E) KEGG 通路富集分析，突出显示与炎症相关的信号通路。F) 代表性差异表达基因的热图。G–H) 基因集富集分析显示，CIMA 处理后 NF-κB、MAPK、PI3K-Akt 和 TNF 相关通路的下调情况。数据以均值 ± 标准差表示（n ≥ 3）。

图9. CIMA纳米颗粒的体内免疫调节能力。A) 种植体周围牙槽骨组织中p65表达的代表性免疫荧光图像。B) 种植体周围CD86⁺ M1型巨噬细胞（红色）和CD206⁺ M2型巨噬细胞（绿色）的代表性免疫荧光图像。C) p65阳性面积占总组织面积比率的定量分析。D) CD86⁺ M1型巨噬细胞面积占总面积比率的定量分析。E) CD206⁺ M2型巨噬细胞面积占总面积比率的定量分析。数据以均值±标准差表示（n ≥ 3）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001，ns：无显著性差异。