食管鳞癌是致死性极高的恶性肿瘤，现有治疗方案对晚期患者效果不佳，靶向肿瘤微环境成为新的研究方向。巨噬细胞胞葬作用在肿瘤微环境中可诱导免疫抑制，但其在食管鳞癌中的调控机制尚未明确。本研究借助单细胞 RNA 测序技术解析食管鳞癌肿瘤微环境的细胞异质性，聚焦肿瘤相关巨噬细胞的胞葬作用，探究其分子调控通路，旨在为食管鳞癌的免疫治疗提供新的靶点和理论依据。
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1.发现食管鳞癌（ESCC）中促肿瘤的 FN1 + 巨噬细胞亚群具有高胞葬活性；
2.转录因子 TP63 通过转录激活 RAC2 增强巨噬细胞胞葬作用；
3.TP63-RAC2 介导的胞葬作用驱动巨噬细胞向 M2 型极化；
4.靶向 TP63-RAC2 轴可抑制巨噬细胞胞葬作用与食管鳞癌肿瘤生长。
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食管鳞癌是高侵袭性恶性肿瘤，预后差、癌症相关死亡率高，多数患者确诊时已达晚期，现有治疗手段疗效有限。肿瘤微环境（TME）是癌症进展和免疫抵抗的关键，胞葬作用作为巨噬细胞清除凋亡细胞的过程，在肿瘤微环境中呈 “双刃剑” 效应，其可通过诱导肿瘤相关巨噬细胞向促肿瘤的 M2 型极化，形成免疫抑制微环境，促进肿瘤生长、血管生成和免疫逃逸。单细胞 RNA 测序技术为解析肿瘤微环境细胞异质性、挖掘巨噬细胞亚型功能及调控通路提供了技术支撑。
本研究探究胞葬作用在食管鳞癌中的作用及分子调控机制，明确肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的异质性特征，挖掘调控巨噬细胞胞葬作用的关键通路，为食管鳞癌寻找新的治疗靶点和策略。
1.单细胞测序分析：对 9 例食管鳞癌患者的 27 份肿瘤组织、配对淋巴结样本进行单细胞 RNA 测序，解析肿瘤微环境细胞组成及异质性，鉴定巨噬细胞亚型并分析其基因表达与功能特征；
2.细胞实验：利用人原代巨噬细胞、THP-1、RAW264.7 等细胞系，通过 siRNA 敲低、过表达、共培养、激光共聚焦、流式细胞术等，验证 TP63-RAC2 轴对巨噬细胞胞葬作用、M1/M2 极化的调控；
3.分子实验：通过 RNA 测序、双荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀（ChIP）、Western blot、qPCR 等，明确 TP63 对 RAC2 的转录调控关系；
4.动物实验：构建小鼠胞葬模型、人源化食管鳞癌小鼠模型，通过体内敲低 / 过表达实验，验证 TP63-RAC2 轴对体内巨噬细胞胞葬作用、极化及肿瘤生长的影响；
5.临床样本验证：利用多重免疫组化（mIHC）分析临床样本中 TP63+、RAC2 + 巨噬细胞的胞葬活性与淋巴结转移的关联。
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1.scRNA-seq 揭示了 ESCC 转录组的全貌
对 9 例初诊未治疗 ESCC 患者的 27 份肿瘤组织、配对淋巴结样本行 scRNA-seq，质控后保留 121,038 个高质量细胞，鉴定出 36 个细胞簇并归为 9 种细胞类型（B 细胞 / 浆细胞、内皮细胞、上皮细胞等）。细胞分布存在高度异质性，肿瘤组织中上皮细胞占比最高且增殖活性最强，其次为髓系细胞；淋巴结中免疫细胞浸润更高。
图1。基于9个簇中特定标记的ESCC细胞类型识别
2.ESCC 肿瘤细胞的异质性
肿瘤细胞被分为 6 个亚型，其中 C2 EZH2+、C3 CENPF + 亚型主要源于肿瘤组织，增殖活性显著，DNA 复制、有丝分裂通路富集，且处于分化轨迹终点，分化能力弱、多样化程度有限。
3.ESCC 中的 T 细胞介导微环境免疫抑制
T 细胞主要来源于淋巴结样本，CD4+ T 细胞可分为 9 个亚型，增殖型 CD4+ T 细胞和 CD4 TIGIT+ Treg 细胞主要来自肿瘤组织，提示肿瘤组织免疫抑制微环境更活跃；CD8+ T 细胞含 3 类耗竭型亚型，其中 CD8 ANXA2 + 耗竭 T 细胞增殖旺盛，或与细胞代谢相关。本研究明确了 CD4+、CD8+ T 细胞在基因表达、功能及发育轨迹上的高度异质性。
4.ESCC 免疫谱显示 TAM 存在特定亚型
TAMs 被分为 7 个亚型，各亚型分布异质性显著：C1 FN1 + 巨噬细胞主要见于增殖活跃的肿瘤组织，C0 TREM2 + 巨噬细胞多来自淋巴结，C3 LGALS2+、C6 VCAM1 + 巨噬细胞主要源于转移相关淋巴结；各亚型具有独特的特征基因表达模式，且表达与样本分组、细胞周期阶段一致。
图2。通过不同标记鉴定出七个巨噬细胞亚型
5.富集分析揭示了不同 TAM 亚型的生物功能
C0 TREM2 + 巨噬细胞富集能量代谢相关通路；C1 FN1+、C2 CD14+、C4 TNFAIP3 + 巨噬细胞富集免疫相关通路，且 “白细胞”“免疫” 评分更高，证实 ESCC 中存在具免疫功能的 TAM 亚型，但其肿瘤免疫作用尚不明确。
6.TAM 亚型中胞葬活性的异质性
原发肿瘤组织中 TAM 的胞葬活性显著高于淋巴结和正常组织，C1 FN1 + 巨噬细胞胞葬活性最高，且处于 M1、M2 表型过渡状态；其胞葬相关基因（ABCG1、AXL、TGM2 等）调控凋亡和脂质代谢，提示 TAM 胞葬作用与脂质加工相关；靶向 PS 的巴维昔单抗可显著降低巨噬细胞胞葬活性。
图3。巨噬细胞在细胞流管作用中的作用
7.TAM 的分化潜力和分化轨迹
CytoTRACE 分析显示 C1 FN1 + 巨噬细胞干性最高、分化程度最低，与 FCGR3A 等免疫相关基因正相关；Slingshot 分析证实 TAM 分化轨迹均始于 C1 FN1 + 巨噬细胞，该亚型富集肽酶、免疫相关通路，低分化、高恶性的特征或与 ESCC 进展快、预后差相关。该亚型兼具强增殖、高胞葬、免疫抑制及高分化潜力，是促 ESCC 免疫抵抗的关键 TAM 亚型。
图4。巨噬细胞分化轨迹和差异表达干基因的可视化
8.转录因子 TP63 调控 C1 FN1 + 巨噬细胞的致癌机制
SCENIC 分析显示调控子活性是 TAM 亚型分类的关键，M1 调控子模块为 C1 FN1 + 巨噬细胞的主要调控元件；在该亚型的五大关键调控因子中，TP63、KLF5 区分亚型和分组的显著性最高，其中 TP63 是调控 TAM 生物学功能的核心驱动因子。
图5。调控因子TP63的鉴定及其体外生物功能的验证
9.TP63 的敲低会损害巨噬细胞体外的胞葬作用
siRNA 敲低实验显示，siTP63-3 可显著降低巨噬细胞中 TP63 表达；体外共培养实验证实，TP63 敲低的巨噬细胞对凋亡 ESCC 细胞（EC9706、KYSE180）的吞噬能力显著下降，说明 TP63 正向调控巨噬细胞胞葬作用。
10.TP63 调节巨噬细胞中的 RAC2 表达
TP63 敲低后，巨噬细胞中 RAC2 的 mRNA 和蛋白水平显著下调；双荧光素酶报告基因、ChIP 实验证实，TP63 可结合 RAC2 启动子的 2/3 结合位点，直接转录激活 RAC2 表达；临床样本中 TP63+、RAC2 + 巨噬细胞的胞葬活性在淋巴结阳性样本中显著增强。
11.TP63 介导的体外胞葬作用通过 RAC2 促进巨噬细胞的极化
RAC2 过表达可恢复 TP63 敲低巨噬细胞的 RAC2 表达，并逆转其胞葬活性的降低；TP63 敲低使巨噬细胞向 M1 型极化（CD86 + 细胞增加、TNF-α 升高），M2 型极化受抑（CD163 + 细胞减少、IL-10/TGF-β 降低），而 RAC2 过表达可逆转该表型变化，证实 TP63 通过调控 RAC2 介导胞葬作用，进而驱动巨噬细胞 M2 型极化。
图6。体外分析了巨噬细胞的回血球作用和极化
12.TP63/RAC2 信号调控体内的胞葬作用
小鼠体内实验显示，shTP63 可降低巨噬细胞 RAC2 表达、抑制胞葬活性，并诱导 M1 型极化，RAC2 过表达可恢复上述表型；人源化小鼠模型中，TP63 敲低显著抑制 ESCC 肿瘤生长，RAC2 过表达则逆转该效应，且 RAC2 敲低同样会损害巨噬细胞胞葬活性。证实 TP63-RAC2 轴调控体内巨噬细胞胞葬和极化，通过塑造肿瘤微环境影响 ESCC 的增殖与转移。
图7。在凋亡性食管癌细胞中，shTP63和shTP63+RAC2的实验研究——C57BL/6 吸血细胞增生小鼠模型
本研究通过单细胞 RNA 测序结合体内外实验，揭示了食管鳞癌中 FN1 + 巨噬细胞亚群为高胞葬活性的促肿瘤亚群，明确 TP63-RAC2 是调控巨噬细胞胞葬作用的核心转录轴 ——TP63 直接转录激活 RAC2，增强巨噬细胞胞葬作用，进而驱动其向 M2 型极化，形成肿瘤免疫抑制微环境，促进食管鳞癌进展。靶向抑制 TP63-RAC2 轴可有效降低巨噬细胞胞葬活性、逆转 M2 型极化，抑制肿瘤生长。该研究阐明了食管鳞癌中胞葬作用的分子调控机制，发现 TP63-RAC2 轴为食管鳞癌免疫治疗的潜在靶点，为开发靶向肿瘤微环境的治疗策略提供了新的理论支撑。同时研究也指出样本量较小的局限性，后续需在更大样本队列中验证，并深入探究通路上下游互作分子。
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