南昌大学江西医学院第二附属医院骨科J. Nanobiotechnol.‌整合声动力气体抗菌疗法与免疫调节的 ROS 响应核壳微针平台用于糖尿病伤口愈合

第一作者：Pinkai Wang, Fanrong Ai, Guanfeng Huang

通讯作者：Jun Tao

通讯单位：南昌大学江西医学院第二附属医院骨科

图 1 CCA 纳米颗粒的表征

(a) CCA 合成示意图；(b) CCA 的透射电镜（TEM）与能谱（EDS）图；(c) Cu-Cy 与 CCA 的粒径分布；(d) Cu-Cy 与 CCA 的 Zeta 电位；(e) Cu-Cy 与 CCA 的傅里叶变换红外光谱（FTIR）；(f) Cu-Cy 与 CCA 的 X 射线光电子能谱（XPS）全谱；(g) Cu-Cy 与 CCA 的 N 1s 高分辨 XPS 谱；(h) Cu-Cy 与 CCA 的 X 射线衍射（XRD）图谱；(i, j) 羟基自由基（・OH）与单线态氧（¹O₂）的电子顺磁共振（ESR）谱；(k) 不同浓度 CCA 在超声刺激下的 NO 生成量（n=3）；(l) 超声开关控制下 NO 的可控释放；(m) NO 生成机制示意图（n=3）。

图 2 核壳结构微针 CCA&Lut@MN 的制备与表征

(a) PVA-HP-Lut 水凝胶的制备示意图；(b) 透明质酸钠（HA）与苯硼酸改性透明质酸（HAPBA/HP）的 ¹H NMR（400 MHz，D₂O）谱；(c) 木犀草素（Lut）、HAPBA（HP）、HP-Lut 水凝胶与 PVA-HP-Lut 水凝胶的 FTIR 谱；(d) 核壳微针 CCA&Lut@MN 的制备示意图；(e) CCA&Lut@MN 微针实物图与局部放大图；(f) CCA&Lut@MN 的扫描电镜（SEM）图：(i) 侧面图，(ii) 单根微针放大图；(g) CCA&Lut@MN 贴片核壳结构代表性图：罗丹明 B（RB）标记的 HA 外壳（红色）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 PVA-HAPBA 内核（绿色），比例尺：100 μm；(h) RB 标记的 CCA&Lut@MN 外壳底部视图共聚焦图，Z 轴扫描间隔 100 μm，比例尺：200 μm；(i) CCA&Lut@MN 贴片上 Cu、Cl、S、N、C 的元素映射图，比例尺：50 μm；(j) CCA&Lut@MN 贴片、外壳微针与内核微针的机械强度，插图为 CCA&Lut@MN 贴片作用于大鼠皮肤后的罗丹明染色穿刺点；(k) 微针刺穿后大鼠背部皮肤的 H&E 染色图，黑色虚线为微针形成的凹陷；(l) HA 微针外壳中 CCA 在 PBS 中的释放曲线（n=3）；(m) CCA&Lut@MN 在 0、0.1、0.25、0.5 mM H₂O₂溶液中的降解速率（n=3）。

图 3 CCA&Lut@MN 的抗菌、ROS 生成与抗生物膜活性评价

(a, b) 不同功率超声处理 CCA 纳米颗粒后 MRSA 与大肠杆菌的活 / 死染色图；(c) 不同组别处理后 MRSA 与大肠杆菌的活 / 死染色及代表性菌落图；(d) MRSA 与大肠杆菌生物膜经 CCA、Lut@MN、CCA&Lut@MN 孵育后 DCFH-DA 染色的共聚焦三维成像图，Z 轴高度 30 μm，比例尺：100 μm；(e) 不同微针处理后 MRSA 与大肠杆菌生物膜的三维共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图，绿色为活菌，红色为死菌，比例尺：100 μm；(f) 不同处理后 MRSA 与大肠杆菌生物膜的 SEM 图，比例尺：3 μm；(g, h) 不同处理后结晶紫染色的 MRSA 与大肠杆菌生物膜代表性显微图，比例尺：4 mm；(i) 结晶紫染色 MRSA 与大肠杆菌生物膜的 570 nm 光密度（OD570）（n=3）；(j) MRSA 与大肠杆菌生物膜的破坏率（n=3）。

图 4 CCA&Lut@MN 微针贴片联合超声处理 MRSA 的 RNA-seq 分析

(a) 所有差异表达基因火山图（绿色：下调；红色：上调；灰色：无显著差异）；(b) CCA&Lut@MN + 超声组与对照组差异表达基因热图分析；(c) 差异基因功能 GO 富集分析（红色：分子功能；蓝色：细胞组分；绿色：生物过程）；(d) 差异基因富集的前 20 条 KEGG 通路。

(a) 不同成分微针与 L929、RAW264.7 细胞共培养后，第 1、3 天活 / 死染色法评估细胞活力（活细胞绿色荧光，死细胞红色荧光）；(b, c) L929 与 RAW264.7 细胞与不同微针共孵育后活细胞比例计算的细胞活力（n=3）；(d) 第 1、3 天 L929 细胞与不同成分微针共培养后鬼笔环肽（绿色，标记肌动蛋白丝）与 DAPI（蓝色，标记细胞核）染色结果；(e) 第 1、3 天 L929 细胞与不同微针共培养的平均铺展面积定量分析（n=3）。

图 6 CCA&Lut@MN 微针的体外 ROS 清除能力、巨噬细胞极化调控及启动组织修复行为

(a) 不同成分微针对 H₂O₂预处理 L929 与 RAW264.7 细胞的 ROS 清除效果；(b) DCFH-DA 探针定量不同成分微针对 L929 与 RAW264.7 细胞的 ROS 清除（n=3）；(c) 巨噬细胞 CD206 与 CD86 的流式细胞分析；(d-g) RAW264.7 细胞中 TNF-α、iNOS、Arg1、IL-10 的相对 mRNA 表达水平（n=3）；(h) 巨噬细胞条件培养基制备与使用流程；(i) 不同处理下人脐静脉内皮细胞（HUVEC）管形成实验代表性图；(j) L929 细胞与巨噬细胞在条件培养基中共培养 0、24、48 小时的划痕伤口代表性图；(k) 划痕实验测定 L929 细胞共培养 24、48 小时的迁移效率（n=3）；(l, m) 不同处理下 HUVEC 的管形成能力（n=3）。

图 7 CCA&Lut@MN 在生物膜感染糖尿病大鼠伤口模型中的伤口愈合与抗菌效果评价

(a) 动物实验示意图；(b) 不同处理下第 0、1、3、7、14 天大鼠伤口代表性图；(c) 感染伤口示意图，比例尺：5 mm；(d) 治疗期间相对伤口面积变化（n=6）；(e) 琼脂平板图；(f) 不同处理后第 3 天伤口组织分离 MRSA 菌落的标准化定量分析（n=3）；(g) 各组第 3、7 天伤口的 Giemsa 染色代表性图，红色箭头指示细菌；(h) Giemsa 染色细菌计数定量分析（n=3）。

图 8 CCA&Lut@MN 微针贴片处理后伤口组织的组织学评价

(a) 二氢乙啶（DHE）荧光定量伤口切片 ROS，比例尺：100 μm；(b) 第 7、14 天伤口组织 H&E 图，比例尺：左 500 μm，放大图 100 μm；(c) 第 14 天伤口切片 Masson 三色图，比例尺：左 500 μm，右 100 μm；(d) 伤口部位平均 DHE 荧光强度定量（n=3）；(e, f) H&E 染色伤口长度统计评估（n=3）；(g) 胶原体积分数统计（n=3）。

图 9 CCA&Lut@MN 微针对糖尿病感染伤口血管形成与巨噬细胞表型的影响

(a) 第 7 天伤口切片 CD86 与 CD206 免疫荧光染色，比例尺：50 μm；(b) 第 7 天伤口区域 CD31 与 α-SMA 免疫荧光染色，比例尺：100 μm；(c, d) 第 7 天伤口切片 CD86 与 CD206 荧光强度定量（n=3）；(e, f) 第 7 天伤口区域新生血管与成熟血管定量分析（n=3）；(g) 各组第 7 天伤口免疫组化染色；(h-l) 基于免疫组化染色图（n=3）对 TNF-α、IL-10、HIF-1α、VEGF-A、TGF-β 阳性面积进行定量分析。

全文链接：https://doi.org/10.1186/s12951-026-04422-1

Journal of Nanobiotechnology

DOI:10.1186/s12951-026-04422-1