南昌大学食品学院刘欢团队在Food Research Internatioanl发表最新研究成果
- 2026-06-14 18:02:13
研究背景
在“精准递送”成为益生菌研究核心命题的当下，如何让活菌真正安全、稳定地抵达结肠，正成为行业突破的关键。益生菌作为能够在足量摄入后改善宿主健康的活性微生物，不仅可调节肠道菌群平衡、增强免疫力、降低胆固醇，还在抗肿瘤等领域展现出潜在应用价值。然而，理想很丰满，现实却很严峻——口服过程中，胃酸、胆盐以及肠道蠕动对菌体构成持续冲击，大部分益生菌尚未抵达结肠便已失活，最终难以发挥预期功效。因此，如何在复杂的胃肠环境中“护送”益生菌安全通行，并在目标部位实现精准释放，成为亟待解决的技术瓶颈。
相比传统的多菌包埋策略，单细胞包封技术可在单个细胞表面构建纳米级别的功能涂层，通过调控结构组成实现更精确的保护与释放控制。其中，基于共价键构建的包封体系──碳二亚胺介导的酰胺化反应，因其结合稳定、结构可控、生物相容性良好而受到广泛关注。另一方面，偶氮苯结构中的−N=N−键可在偶氮还原酶或缺氧环境下发生特异性断裂，具备良好的刺激响应特性，为实现结肠特异性释放提供了分子基础。然而，将偶氮功能化多糖用于单细胞益生菌包覆并构建智能响应递送系统，仍有待深入探索。
基于此，研究以酵母β-葡聚糖为天然骨架，引入响应性偶氮苯结构制备得到偶氮修饰多糖（AA-YBG），并通过碳二亚胺介导的酰胺化反应将其共价偶联至益生菌EcN表面，构建单细胞纳米包封体系EcN@AA-YBG。在系统完成材料结构与理化性质表征的基础上，进一步评估其生物相容性、体外胃肠耐受性、结肠响应释放行为及环境适应能力。该策略实现了对益生菌的稳定保护与结肠特异性释放，为开发具有刺激响应功能的精准益生菌递送平台提供了新的研究思路。
结果与讨论
1
天然酵母β-葡聚糖的结构改造与理化性质重构
表 天然和改性酵母β-葡聚糖的分子量（kDa）和取代度（DS）
围绕酵母β-葡聚糖（YBG）的功能升级，研究通过偶氮苯基团修饰构建改性酵母β-葡聚糖（AA-YBG），并系统解析其分子结构变化。结果显示，天然YBG分子量为3.16 kDa，而修饰后出现4.29 kDa与16.01 kDa两个分布峰，取代度由0提升至0.60，说明偶氮苯基团已成功接枝至多糖的糖链上。单糖组成分析证实天然YBG以葡萄糖为绝对优势组分（98.2%），主链结构完整。红外与¹H-NMR谱图进一步验证改性多糖成功：AA-YBG中出现典型C=O、−N=N−及芳香环烃的特征吸收峰，核磁谱图在6.4–8.2 ppm出现芳香质子信号，表明偶氮苯结构被稳定引入。同时，改性后ζ电位由−2.48 mV下降至−10.44 mV，表面负电性增强；溶解度由95.57%降至76.50%，反映出疏水芳香结构引入与分子间相互作用增强。这些变化共同证明，在不破坏天然多糖YBG骨架的前提下，实现了功能基团的精准构建，制备出可响应性改性酵母β-葡聚糖，为后续构建响应型递送系统奠定了分子基础。
图 天然酵母β-葡聚糖和偶氮苯改性酵母β-葡聚糖的物理化学特征：（a）HPAEC色谱图；（b）HPAEC-PAD色谱图；（c）傅里叶变换红外光谱；（d）1H NMR光谱；（e）ζ-电位特征；（f）溶解度分析。
2
EcN@AA-YBG 单细胞纳米体系的构建与结构表征
将AA-YBG共价偶联在EcN表面，构建单细胞纳米涂层体系。流式细胞术显示双荧光标记后大量细胞进入双阳性区域，证明AA-YBG成功锚定于EcN表面。包覆后EcN的ζ电位由−18.77 mV降至−41.30 mV，粒径由约910 nm增至1204 nm，表明其表面形成了稳定的多糖聚合物层。扫描电镜与透射电镜观察到菌体表面由光滑转为粗糙，并出现清晰均一的薄膜结构；荧光显微成像亦显示AA-YBG荧光信号与菌体轮廓高度重叠。傅里叶红外光谱分析中，EcN中细胞膜蛋白相关酰胺峰强度降低，同时出现芳香环烃与β-葡聚糖特征峰，说明AA-YBG通过氨基与羧基之间的共价作用牢固嵌合于EcN表面。整体来看，该多糖纳米涂层结构清晰、结合稳固，为益生菌赋予可调控的界面功能。
图 EcN@AA-YBG的形态学特征：（a）流式细胞术验证；（b）ζ-电位分析；（c）粒度分布分析；（d）扫描电镜分析；（e）透射电子显微镜分析；（f）荧光显微镜共定位分析；（g）傅里叶变换红外光谱分析。
3
良好生物相容性：在安全范围内实现功能增强
生物安全性是益生菌递送系统应用的前提。无论YBG还是AA-YBG与EcN共培养，其生长曲线均与对照组无显著差异，说明多糖材料本身不抑制菌体增殖；AA-YBG包覆后EcN的生长情况亦与天然EcN基本一致，证明多糖纳米涂层未阻碍菌体本身与外界环境的物质交换或对其造成机械约束。各组样品溶血率均低于25%的安全阈值，远低于阳性对照水平，显示出良好的血液相容性。相比部分无机纳米涂层可能因氧化应激导致细胞损伤，AA-YBG共价涂层在保持结构稳定性的同时，未对菌体活性产生负面影响，体现出天然多糖经改性后的改性多糖基质在活体递送系统中的安全优势。
图 AA-YBG和EcN@AA-YBG的生物相容性：（a） YBG和AA-YBG与EcN共培养的生长曲线；（b）EcN和EcN@AA-YBG的生长曲线；（c）AA-YBG、EcN和EcN@AA-YBG的溶血率。.
4
胃肠环境保护与结肠响应释放双重机制构建
在模拟胃液与肠液环境中，未经包封的EcN在0.5小时内几乎完全失活，而EcN@AA-YBG在完整消化流程后仍保持超过77%的存活率。活细胞和死细胞荧光染色显示，EcN@AA-YBG在胃液与肠液处理后仍以绿色活菌信号为主，电镜观察亦证实其细胞膜结构完整，说明AA-YBG形成的致密纳米涂层有效阻隔胃酸与胆盐侵蚀。
相比于EcN，包覆后体系EcN@AA-YBG整体清除自由基能力明显提高，即AA-YBG具备抗氧化能力。更关键的是，偶氮键（−N=N−）在结肠环境中可被偶氮还原酶切割或低氧条件触发断裂，紫外全波段扫描显示的特征吸收峰消失，证明AA-YBG的偶氮键结构被切断，从而实现益生菌的定点释放。同时，AA-YBG的包封显著增强EcN对黏蛋白与转铁蛋白的黏附能力，表面疏水性由22%提升至36%，结合静电与疏水相互作用，有助于提升EcN@AA-YBG的结肠定植潜力，构建“保护—响应—黏附”一体化递送机制。
图 EcN@AA-YBG的体外模拟胃肠消化特性：（a） EcN@AA-YBG对胃酸和胆汁盐的耐受性示意图；（b）存活率；（c）荧光显微镜分析；（d）扫描电镜分析。
图 EcN@AA-YBG的结肠靶向释放和粘附特性：（a）YBG和AA-YBG以及（b）EcN和EcN@AA-YBG的抗氧化能力；（c）AA-YBG和EcN@AA-YBG（d）的酶响应性降解；（e）AA-YBG和（f）EcN@AA-YBG的缺氧反应性降解；EcN的和EcN@AA-YBG（g）.粘蛋白和转铁蛋白粘附的荧光图像，以及（h）相应的相对强度；（i）EcN的和EcN@AA-YBG疏水性。
5
不同环境下抗压能力提升：从高温、抗生素到氧化应激的系统强化
在45–65°C热处理条件下，未经包封的EcN存活率急剧下降，而EcN@AA-YBG在65°C仍保持约80%的存活率，表明多糖纳米涂层可以延缓热传导并稳定膜蛋白结构。同时，涂层可有效隔离阿莫西林与诺氟沙星对菌体的直接攻击，使其在抗生素环境中仍维持稳定活性。
而在4°C条件下EcN@AA-YBG的长期存活率显著高于对照组，AA-YBG在菌体表面形成的多糖涂层既作为物理屏障减少氧与水分侵扰，又可作为潜在的益生元，维持益生菌的基础代谢。面对氧化应激挑战，EcN@AA-YBG显著降低ROS水平，经H₂O₂处理后存活量比自由EcN高出4.0 Log CFU/mL，体现出纳米涂层的屏障与抗氧化结构的双重保护作用。
图 EcN和EcN@AA-YBG的在不同环境的抵抗能力：（a）在不同温度（45℃、55℃和65℃）下，（b）与阿莫西林和（c）诺氟沙星孵育后，（d）在4℃和25℃下储存后的细胞存活率；在用1mM H2O2孵育前后，EcN和EcN@AA-YBG的（e）荧光显微镜图像；（f）荧光光谱分析；（g）用1mM H2O2孵育后的细胞存活率。.
结论与展望
研究构建的偶氮功能化多糖单细胞包封递送体系，不仅在结构层面实现了稳定、可控的共价锚定，更在功能层面建立了“胃肠保护—结肠响应—定点释放”的完整递送逻辑。AA-YBG在胃酸与胆盐环境中为EcN提供物理与化学双重屏障，而其偶氮键在结肠还原环境下发生特异性断裂，实现菌体的精准释放与定植增强，从而显著提升益生菌在肠道中的有效存活与功能表达潜力。这类可控释放、环境响应型的单细胞包封递送系统，是口服益生菌递送的一个有前景和多功能的平台，为炎症性肠病等肠道疾病的干预策略提供更加坚实的实验与理论支撑。
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0963996926003352
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