近日，南昌大学食品学院食品营养与健康创新团队的硕士研究生梁业慧、邓泽元教授、李静教授等人在国际期刊Food Research International发表了题为“Multilayer assembled MFGM mimetics improve digestive fate of human milk structural lipids”的文章。该研究通过乳铁蛋白与乳磷脂逐层自组装，成功构建了模拟母乳MFGM的多层仿生脂肪球膜（LF-MPL），证明了LF-MPL可以显著改善脂质在胃肠阶段的消化，并促进脂肪酸与母乳结构脂的吸收。第一作者为2023级硕士研究生梁业慧，通讯作者为李静教授。
（原文链接）
https://doi.org/ 10.1016/j.foodres.2025.118055
乳铁蛋白，乳磷脂，仿生脂肪球膜，逐层自组装，脂肪消化
1.LF-MPL通过静电层次组装技术模拟MFGM的多层结构。
2.LF-MPL多层膜显著提升了脂肪球的热稳定性和离子稳定性。
3.LF和MPL分子之间的疏水性相互作用驱动了自发的吸热反应。
4.LF-MPL多层膜实现了母乳中结构脂质的“胃保护-肠道增强”。
母乳是新生儿重要的营养和免疫保护来源，含有复杂的脂质成分，这些脂质以乳化物形式以球状扩散，这种结构通常被称为乳脂球（MFG）。MFG的核心是甘油三酯（TAG），覆盖着富含磷脂和蛋白质的三膜结构乳脂球膜（MFGM）。MFGM是一种天然乳化剂，能够确保系统的稳定性。研究表明，MFGM在脂质消化过程中与脂肪酶相互作用，影响脂解和吸收。MFGM的结构和组成可以促进脂肪酶在油-水界面的锚定，并与胆汁盐相互作用以促进脂质消化。其磷脂层通过调节脂肪球的大小和表面特性，影响胰腺脂肪酶的吸收和水解效率。最终，脂解速率加快，游离脂肪酸（FFA）释放增加。;
尽管MFGM的结构和成分已被证实富含营养，且现有婴儿配方奶模拟了母乳的总脂质含量和脂肪酸（FA）组成，但脂肪球的结构与母乳有显著差异。为了模拟天然MFG的结构，现有研究重点是MFGM与来自不同来源（如大豆、牛奶等）的极性脂质结合，但其结构仍与天然MFGM的多层结构有较大差异。目前，大量研究致力于通过添加MFGM成分开发先进婴儿配方奶粉，以实现与母乳脂肪球结构更为相似的过程。然而，MFGM的结构与多层结构之间仍存在显著差异，导致脂质供应较低。当前的研究仍处于实现更接近母乳脂肪球的消化模型与实现进一步母乳喂养婴儿液体配方奶粉目标之间的差距。
为模拟MFGM的多层结构，该研究选用了牛奶蛋白和牛奶磷脂（MPL）作为膜材料。MPL是从乳制品中提取的，以模拟天然牛奶磷脂的组成。由于MPL在中性pH值下带负电，我们首先筛查了带正电的乳蛋白。基于等电点、乳化特性和乳化稳定性，乳铁蛋白（LF）比酪蛋白（CN）和乳清蛋白（WP）更适合制备仿生脂肪球多层的内层膜。这项工作的创新之处在于利用一个明确的双组分系统，战略性地构建并阐明仿生乳脂球膜。与以往依赖复杂MFGM浓缩物或非乳制磷脂的研究不同，我们的方法采用了乳铁蛋白（LF）和牛奶磷脂（MPL）的理性层层组装，构建了一个受控模型系统。该设计使我们首次能够精确解析分子相互作用机制，这是一种由疏水力驱动的自发吸热过程，支撑着LF-MPL多层界面的形成。此外，通过系统比较LF-MPL与WP-MPL，我们独特地界定了特定内层蛋白层在脂质消化命运中的作用。最终，该研究提出了一种“胃保护-肠道协同”机制，为仿生多层结构如何动态调节母乳结构脂质的消化和吸收提供了新的理论框架。
# Results and Discussion #
1）、2%乳铁蛋白最适合作为制备多层仿生脂肪球膜的内层材料
该研究分析比较乳清蛋白（WP）、酪蛋白（CN）和乳铁蛋白（LF）的乳化特性（EAI、ESI）和等电点，以筛选仿生脂肪球膜的内层蛋白膜材料。结果显示，乳铁蛋白在不同pH条件下带整点，无需调整pH。乳铁蛋白和乳清蛋白表现出更稳定的乳化稳定性和更好的乳化活性。酪蛋白在中性pH条件下携带净负电荷，无法促进与MPL的静电相互作用。综合考虑蛋白质带电特性和乳化特性后，选择了LF和WP（pH=3.0）作为内界面的原料。
进一步通过不同蛋白质浓度对脂肪球乳液的粒径大小、Zeta电位和界面蛋白载荷的影响，筛选内层蛋白膜材料的浓度。结果显示，乳清蛋白的粒径大小随着乳清蛋白浓度的增加而减小。这可能是由于蛋白质浓度增加，覆盖更多脂肪球表面积，导致脂肪球颗粒更小。被乳铁蛋白乳液包裹的脂肪球表面电位均较高，表明脂肪球表面完全被蛋白质覆盖。为了获得稳定的多层膜结构，内层膜被设计为高正电荷和小颗粒的特性。因此，选择了2%乳铁蛋白来制备具有高正电荷（+19.67 ± 1.27 mV）和小颗粒（277.85 ± 6.15 nm）的蛋白质层乳液。
为确保稳定的蛋白单分子层乳液形成并成功吸附磷脂，进一步研究了蛋白浓度对乳液界面蛋白载荷的影响。脂肪球被LF单层包裹的界面蛋白负荷随着蛋白质浓度增加而增加，最终达到饱和，而WP浓度的增加对界面蛋白负荷影响不大。结合微观结构，WP成功吸附在脂肪球表面，但形成的界面膜不连续，界面蛋白出现局部缺陷或脱落现象，LF可以完全覆盖脂肪球表面，导致表面具有高正电荷密度，通过强静电排斥有效抑制液滴聚集，形成均匀乳液。因此，选择了浓度为2%的LF乳液作为仿生多层乳脂球膜的内层蛋白膜，并通过逐层吸附乳磷脂构建了稳定的多层界面系统。
2）、LF（2%）和MPL（2%）将脂肪球包裹形成稳定的多层膜结构
不同浓度的乳磷脂对LF单层乳液的Zeta电位、粒径分布存在一定影响，反映界面电荷特性和吸附行为的动态演变。结果显示，低浓度MPL部分覆盖了LF界面，形成不连续的磷脂-蛋白质复合层，界面电荷分布不均，液滴颗粒尺寸显著增加。当MPL浓度增加到2%时，乳液Zeta电位趋于稳定，表明MPL已完全吸附在LF表面。脂肪球表面的高负电荷密度通过静电排斥抑制了液滴的聚集，液滴的平均颗粒尺寸减小，形成稳定的多层膜。结合微观结构图像，蛋白质在脂肪球体上或周围形成了清晰的绿色环，表明蛋白质膜的形成。蓝色荧光集中在脂肪球的边缘，表明脂肪球表面形成了磷脂膜。综合图像揭示了乳液中脂肪球的形态特征，以及脂肪球表面MPL和LF的完整多层结构。结合磷脂后Zeta电位的变化，2%的LF和2%的MPL形成了多层膜，LF为内膜，MPL为外膜。
3）、LF和MPL分子之间的相互作用主要是一种由疏水相互作用驱动的自发吸热反应过程
LF和MPL可以通过静电吸附形成多层界面，但界面膜上的相互作用机制仍不清楚。该研究通过荧光淬灭技术和傅里叶变换红外光谱（FTIR）研究了界面处LF与MPL之间的相互作用机制。
通过比较LF单层乳液和LF-MPL多层仿生脂肪球膜乳液的红外光谱，揭示了LF与LF-MPL之间的分子相互作用机制及MPL对LF构象的影响。与LF相比，LF-MPL的O—H基团拉伸形成的峰值从3292.62 cm−1蓝移至3299.23 cm−1吸收强度也随之增加。这可能是因为PO2−之间的互动MPL中的基团或极头基团通过氢键与LF中的—OH基团或N—H基团相互作用，从而增强了配合物中氢键网络的密度。氢键的增加不仅稳定了LF-MPL的界面结构。它还可以通过限制分子链段的自由流动，影响乳液的流变性质。加入MPL后，LF-MPL中由对称和不对称C—H拉伸振动形成的吸收峰从2933.9 cm−1红移到2923.85 cm−1表明MPL的疏水尾部与LF的疏水区疏水结合，暴露了LF内部的疏水基团并增加疏水性，这有利于多层膜的紧密排列，减少界面张力，从而增强乳剂稳定性。红外光谱结果中可见LF-MPL的酰胺I、II带均发生了移动，表明LF二级结构发生变化。此外，由P=O振动产生的峰值也会明显偏移，这可能与PO2−之间的静电相互作用有关以及在LF-MPL多层膜复合形成过程中的—CO—NH。总而言之，LF与MPL相互作用后增强的疏水性和氢键网络赋予乳剂独特的界面特性。
从荧光结果中可见，加入MPL后，336 nm处低频的荧光强度逐渐降低，最大荧光强度下降，最大峰波长几乎不变，表明LF与MPL之间存在相互作用。结合LF与MPL结合位点数和结合常数的分析，n值在不同温度下都接近于1，表明结合位点只有一种类型。结合常数随温度增加而增加，表明LF与MPL之间的结合是一种高度相互作用的吸热过程。综合而言，LF与MPL分子之间的相互作用主要是一种由疏水性相互作用驱动的自发吸热反应过程。
4）、LF-MPL实现了母乳中结构脂质的“胃保护-肠道增强
该研究检测脂滴分布、Zeta点位和粒径大小分布、游离脂肪酸释放以及蛋白水解程度，进一步研究模拟消化体外消化过程中包裹脂质的多层膜和单层膜的消化特性。从微观结构看，经过模拟胃消化60分钟后，LF-MPL多层膜仍保持良好的磷脂环结构，表明MPL层通过物理屏障延缓胃蛋白酶对蛋白质的消化，维持多层膜的连续环状结构，减少蛋白质聚集体的形成，抑制脂滴絮凝。经过肠道消化120分钟后，蛋白-磷脂膜已被完全破坏。LF-MPL更好地结合脂肪酶作用位点，从而增强肠道中的脂质消化。
在体外消化具有不同界面结构的乳液时，脂肪球表面Zeta电位和粒径大小分布的动态变化。在胃消化过程中，乳液中液滴的颗粒大小显著增加，绝对Zeta电位值下降。与其他乳剂相比，LF乳液的绝对Zeta势值先升后降，表明胃蛋白酶通过水解LF导致电荷反转。随着肠道消化的推进，所有乳剂中脂滴的粒径随着胰脂酶水解的进行而减小，绝对Zeta电位值增加。肠道消化暴露并分解了更多的甘油三酯。WP和WP-MPL乳剂的粒径分布呈不均匀的双峰分布，而LF和LF-MPL保持单峰分布，这可能与WP和LF不同的等电点有关。
随着消化过程的推进，胰脂肪酶迅速水解甘油三酯，FFA释放显著增加，肠道消化120分钟后，LF-MPL乳液中的FFA释放量显著更高，进一步通过一阶动力学模型拟合，具有不同界面结构的脂肪球的一阶速率常数展示了LF-MPL>WP-MPL>LF>WP趋势，表明LF-MPL多层膜模拟MFGM可以增加FFA的释放，表明LF-MPL多层膜结构可促进肠道消化过程中脂肪球的脂解。此外，通过SDS-PAGE表征消化过程中蛋白质水解程度，可见，肠道消化结束后，WP和LF蛋白条带缺失，表明蛋白完全水解，加入MPL后，对蛋白水解效果无显著影响，LF-MPL多层膜结构对膜蛋白的水解没有显著影响。
5）、LF-MPL促进体内外对结构脂质的吸收和运输
在体外消化中，LF-MPL多层膜显著延缓了胃消化的脂解速率，并促进了肠道消化过程中胰脂酶的定向吸附。然而，多层膜结构对肠道吸收的影响尚不明确。因此，利用Caco-2单层细胞和动物模型，探讨体外和体内不同界面结构的脂肪球吸收差异，为婴儿配方奶粉仿生设计提供理论基础。
结果显示，LF-MPL和WP-MPL组的TAG合成含量显著高于不添加MPL的单层膜组。Caco-2细胞在与结构脂质消化液孵育24小时后，向基底侧培养基分泌甘油三酯，这反映了该细胞模型中的脂质吸收和分泌情况。结果显示，培养具有不同脂肪球界面结构的消化后，TAG的运输显著增加，TAG分泌量在LF-MPL中最高，其次是WP-MPL。基于此，对多层膜结构对细胞中脂质转运和脂质分泌相关基因表达的影响进一步探讨。结构不同的脂肪球消化物以不同方式影响脂肪酸转运（FATP4）、脂质代谢（DGAT1和DGAT2）以及乳幼微粒形成（APOB、APOA4和MTTP）的基因调控。结果显示，LF-MPL组中FATP4、APOB、APOA4和MTTP的mRNA表达水平显著升高，而DGAT1和DGAT2与WP-MPL组无显著差异。这一结果提示仿生多层膜模拟MFGM包裹着的脂肪球被肠道细胞更好地吸收和运输。
进一步分析不同界面结构的脂肪球对SD大鼠血清脂质参数的影响。结果显示，LF-MPL组和WP-MPL组的餐后TAG浓度保持较高，显著高于对照组。LF-MPL组TAG浓度曲线下面积（AUC）显著高于WP-MPL。不同界面结构脂肪球乳液对对大鼠血清TC、LDL-C或HDL-C浓度无显著影响。此外，LF-MPL和WP-MPL中血清中PA的最大值高于对照组，OA浓度曲线也比对照组更为平滑，表明LF-MPL和WP-MPL显著提高了血清脂肪酸浓度，这可能归因于其界面结构特性。LF-MPL和WP-MPL形成更稳定的多层结构，延缓胃消化过程中脂质的水解，并确保更多长链脂肪酸进入肠道吸收。
通过采用静电层沉积技术。以2%的LF和2%MPL作为膜材料，成功构建了仿生脂肪球膜LF-MPL。在脂肪球表面形成了致密且均匀的LF-MPL膜，模拟了MFGM多层结构，显著提高了乳剂的稳定性。LF-MPL多层结构中LF和MPL分子的相互作用主要是一个由疏水力驱动的自发吸热过程。LF-MPL多层结构改善了胃消化过程中脂肪球的稳定性，并促进了肠道脂质的释放。与此同时，LF-MPL促进细胞和大鼠体内TAGs和FA的积累和分泌，并显著上调了相关的mRNA在细胞中脂质吸收和代谢的表达。该研究表明，LF-MPL多层膜通过改善脂肪球的界面结构，可以通过影响脂肪球的消化来提升脂质的生物利用度。
本研究利用体外和细胞模型，系统评估了母乳脂质及其甘油三酯类似物的消化和吸收特性。母乳脂质因其独特的三酰甘油结构，展现出了最佳的消化稳定性和生物利用度。在各类似物中，M1和M5脱颖而出，成为最具前景的候选物，它们在脂解程度、微观结构等方面与母乳脂质高度相似。然而，甘油三酯分泌的差异凸显了在复现母乳生物学复杂性方面面临的挑战。这些结果强调了甘油三酯立体化学在婴儿营养中的关键作用，并为优化婴儿配方奶粉提供了框架。未来研究应侧重于通过组合方法优化甘油三酯类似物，并在临床环境中验证其功效，以弥合母乳与婴儿配方奶粉在脂质功能方面的差距。
梁业慧，食品科学与工程专业硕士在读。以第一作者发表SCI论文1篇，主要研究方向为功能脂质。
李静，博士，教授，博士生导师。江西省杰出人才，南昌大学215人才。中国注册营养师，江西省营养学会常务理事兼副秘书长，江西省营养学会科普分会副主任委员，南昌市营养学会副会长兼秘书长，江西省食品科学技术学会理事，江西省微量元素与健康研究会常务理事，江西省营养学会营养转化分会委员，教育部学位中心学位论文评审专家。近年来获得江西省科技进步奖2项，中国产学研创新成果奖1项，中国食品科学技术学会技术创新一等奖1项，江西省教学成果奖1项，南昌大学教学成果奖2项，南昌大学第五届教师授课比赛二等奖。主持10余项国家自然基金、教育部基金、省科技厅基金、省教育厅基金，食品科学与技术国家重点实验室基金。主持、参与并完成伊利、澳优、益海嘉里、无限极等企业横向课题10余项。在Scientific report, Journal of Agricultural and Food chemistry, Food&Function等杂志上发表论文40余篇。申请专利24项，授权专利10项。参编著作4部。
邓泽元，二级教授，博士生导师。南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室固定研究人员。享受国务院特殊津贴，赣鄱英才555工程人才、江西省新世纪百千万人才工程人选，江西省高校中青年学科带头人，首届江西省优秀硕士指导教师，江西省高等学校教学名师，获得教育部优秀中青年教师（支助），江西省主要学科学术与技术带头人，“食品科学”与“营养与食品卫生学”重点学科带头人。现任中国农学会微量元素与食物链分会副理事长，中国粮油学会营养分会副会长，中国营养学会营养转化医学分会副主任委员，江西省微量元素与健康研究会名誉理事长，江西省营养学会理事长；美国化学学会（ACS）会员、国际食品学会（IFT）会员，《食品科学》、《农产品加工学刊》、《食品安全质量检测学报》、《乳业科学与技术》、《南昌大学学报》（理科版）、J of Agri. Food Chem.和J of Food Biochem.编委，中国保健食品评审专家。
