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1.一个促肿瘤FN1+巨噬细胞在ESCC中表现出高细胞增多

2.TP63通过转录激活RAC2，增强巨噬细胞的显化细胞作用

3.TP63-RAC2介导的富球吞吐作用驱动巨噬细胞的M2极化

4.靶向TP63-RAC2轴可抑制病化胞增症和肿瘤生长

食管鳞状细胞癌（ESCC）恶性程度高、预后差，是全球癌症相关死亡的主要原因之一。现有治疗手段对晚期患者疗效有限，肿瘤微环境（TME）介导的免疫抵抗是关键瓶颈。巨噬细胞胞葬作用（吞噬凋亡细胞）在维持组织稳态的同时，可诱导 M2 极化形成免疫抑制微环境，但其在 ESCC 中的调控机制尚未明确。本研究聚焦胞葬作用的分子调控网络，旨在为 ESCC 开发靶向免疫微环境的新型疗法。

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1单细胞 RNA 测序：对 9 例 ESCC 患者的 27 份样本（肿瘤组织及配对淋巴结）进行测序，解析细胞异质性，聚焦巨噬细胞亚型与胞葬相关基因表达；

2体外实验：通过 siRNA 敲低 TP63、RAC2，或过表达 RAC2，结合共培养、流式细胞术、免疫荧光等验证巨噬细胞胞葬活性与极化表型；

3分子机制验证：采用 luciferase 报告基因 assay、染色质免疫沉淀（ChIP）验证 TP63 对 RAC2 的转录调控；

4体内实验：构建小鼠腹腔注射凋亡细胞模型、胸腺胞葬模型及人源化 ESCC 小鼠模型，评估靶向 TP63-RAC2 轴对胞葬作用、巨噬细胞极化及肿瘤生长的影响；

5生物信息学分析：通过基因富集分析、细胞轨迹分析等解析巨噬细胞功能特征与分化路径。

1.scRNA-seq揭示了ESCC转录组的全貌

我们对 9 名未接受过治疗的新诊断 ESCC 患者的 27 份样本（肿瘤组织及配对淋巴结）进行 scRNA 测序，经质控后保留 121,038 个高质量细胞，识别出 36 个细胞簇并归类为 9 种细胞类型（B 细胞和浆细胞、内皮细胞等）。不同患者及同一患者不同部位的细胞分布异质性显著，肿瘤组织中上皮细胞占比最高且增殖活性最强，其次是髓系细胞，淋巴结中 B 细胞、T 细胞等免疫细胞浸润更丰富。

图1  基于9个簇中特定标记的ESCC细胞类型识别

2.ESCC肿瘤细胞的异质性

利用 scRNA-seq 数据剖析 ESCC 细胞异质性，发现肿瘤细胞可分为 6 个亚型。其中 C2 EZH2⁺和 C3 CENPF⁺肿瘤细胞源自肿瘤组织，DNA 复制与有丝分裂通路富集，增殖活性强；且二者位于分化轨迹终点，分化能力弱、多样化程度有限，是 ESCC 中活跃增殖的核心肿瘤细胞亚型。

3.ESCC中的T细胞介导微环境免疫抑制

T 细胞主要源自淋巴结样本，CD4⁺T 细胞分为 9 个亚型（含增殖型、Treg 细胞等），其中增殖型 CD4⁺T 细胞与 CD4⁺TIGIT⁺Treg 细胞多来自肿瘤组织，提示肿瘤组织免疫抑制更活跃；CD8⁺T 细胞含 3 种耗竭型亚型等，CD8⁺ANXA2⁺耗竭 T 细胞增殖活跃且与细胞代谢相关。研究明确了 ESCC 中 CD4⁺、CD8⁺T 细胞亚型在基因表达、功能及发育轨迹上的高度异质性。

4.ESCC免疫谱显示TAM存在特定亚型

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是 ESCC 微环境中最丰富的免疫细胞，降维聚类将其分为 7 个亚型（C0 TREM2⁺、C1 FN1⁺等），分布异质性显著。其中 C0 TREM2⁺巨噬细胞源自淋巴结（G1/S 期），C1 FN1⁺巨噬细胞多见于活跃增殖的肿瘤组织（G2M/S 期），C2 CD14⁺、C4 TNFAIP3⁺巨噬细胞主要来自肿瘤组织，C3 LGALS2⁺、C6 VCAM1⁺巨噬细胞源自转移相关淋巴结；各亚型有独特特征基因表达模式，与样本分布及细胞周期阶段一致。

图2 通过不同标记鉴定出七个巨噬细胞亚型

5.富集分析揭示了不同TAM亚型的生物功能

差异基因分析揭示 ESCC 中不同 TAM 亚型的生物学功能差异：C0 TREM2⁺巨噬细胞富集能量代谢相关通路（如脂质代谢、有氧呼吸）；C1 FN1⁺、C2 CD14⁺、C4 TNFAIP3⁺巨噬细胞则富集防御反应、免疫反应等免疫相关通路，且 GO-BP 分析中 “白细胞”“免疫” 得分较高，提示这些亚型具有免疫相关功能，但具体在肿瘤免疫中的作用尚待明确。

6.TAM亚型中驱化胞浆活性的异质性

肿瘤免疫功能与 TAMs 胞葬活性密切相关，原发肿瘤组织中 TAMs 的胞葬活性显著高于淋巴结及正常组织，提示原发灶免疫抑制更强，胞葬作用或为 ESCC 治疗靶点。TAM 亚型中 C1 FN1⁺巨噬细胞胞葬活性最高，处于 M1-M2 过渡状态，其相关基因（ABCG1、AXL 等）调控凋亡与脂质代谢，与胞葬作用相关；体外实验证实，巴维昔单抗可降低巨噬细胞胞葬活性。

图3 巨噬细胞在细胞增殖活性中的作用

7.TAM的分化势和分化轨迹

通过轨迹分析与 CytoTRACE 评估发现，C1 FN1⁺巨噬细胞的细胞干性最高，分化程度最低、分化潜力较强，其干性特征可能与 FCGR3A、C1QC 等免疫相关基因的正相关表达有关。

图4 巨噬细胞分化轨迹及差异表达干基因的可视化

Slingshot 分析显示，TAM 分化轨迹始于不同组织来源和细胞周期中的 C1 FN1⁺巨噬细胞，其处于分化早期阶段。富集分析表明，该亚型在第一条分化路径中富集肽酶相关通路（影响胞葬作用），第二条路径中富集免疫相关通路。结合此前结果，C1 FN1⁺巨噬细胞分化程度低、恶性程度高，兼具强增殖、高胞葬活性及免疫抑制功能，是促进 ESCC 进展与免疫抵抗的关键 TAM 亚型。

8.转录因子TP63调控C1 FN1巨噬细胞的致癌机制+

通过 SCENIC 分析解析 C1 FN1⁺巨噬细胞调控网络，发现调控子活性是 TAM 亚型分类的关键，不同亚型间差异显著。C1 FN1⁺巨噬细胞的五大关键调控因子中，TP63 和 KLF5 在区分 TAM 亚型与组别时显著性最高、AUC 更突出，其中 TP63 是调控该亚型致癌机制及 TAM 生物功能的核心驱动因素。

图5 调控因子TP63的鉴定及其体外生物功能的验证

9.TP63介导的体外驱化胞吐作用通过RAC2促进巨噬细胞的极化

体外实验验证，RAC2 是 TP63 的下游调控因子：过表达 RAC2 可恢复 TP63 缺失巨噬细胞中的 RAC2 表达，并挽救其对凋亡 EC9706 细胞的吞噬能力。TP63 敲低会减少 M2 巨噬细胞（F4/80⁺CD163⁺）、增加 M1 巨噬细胞（F4/80⁺CD86⁺），且下调 M2 标志物 IL-10、TGF-β，上调 M1 标志物 TNF-α，而 RAC2 过表达可逆转这些表型变化，表明 TP63 通过调控 RAC2 介导巨噬细胞 M2 极化。

图6 体外分析了巨噬细胞的回血球作用和极化

10.TP63/RAC2信号调控体内的感化胞吐作用

体内实验证实，TP63/RAC2 信号调控巨噬细胞胞葬作用与极化：shTP63 处理会降低巨噬细胞 RAC2 表达、抑制胞葬活性、减少 M2 极化并增强 M1 极化，过表达 RAC2 可逆转这些表型。人源化小鼠模型中，TP63 敲低能抑制 ESCC 肿瘤生长，而 RAC2 过表达会抵消该效应；RAC2 敲低则损害巨噬细胞胞葬功能。这表明 TP63-RAC2 轴通过调控胞葬作用和 TME 重塑影响 ESCC 进展，为治疗靶点。

图7 在凋亡性食管癌细胞中，shTP63和shTP63+RAC2的实验研究——C57BL/6 吸血细胞增生小鼠模型

本研究通过单细胞 RNA 测序鉴定出 ESCC 中高胞葬活性的 FN1⁺巨噬细胞亚群，证实其通过 M2 极化促进免疫抑制。分子机制上，转录因子 TP63 直接结合 RAC2 启动子并激活其表达，形成 TP63-RAC2 通路调控巨噬细胞胞葬作用。体内外实验表明，敲低 TP63 可抑制巨噬细胞胞葬活性、减少 M2 极化，而过表达 RAC2 可逆转该表型；靶向 TP63-RAC2 轴能有效抑制 ESCC 肿瘤生长。研究揭示了 ESCC 免疫抑制微环境重塑的关键机制，为 ESCC 提供了 “胞葬作用 - 免疫调控” 的新型治疗靶点，为开发靶向肿瘤微环境的疗法奠定了基础。