中长链甘油三酯（MLCT）是一种新型功能性脂质，当长链多不饱和脂肪酸位于甘油骨架的sn-2位时可表现出更高的生物利用度。二十二碳六烯酸（DHA）是一种重要的长链多不饱和脂肪酸，具有改善认知功能以及抗炎、抗肿瘤等活性，但其α-亚麻酸内源性转化为DHA的效率极低，因而定向制备sn-2位富含DHA的MLCT具有重要意义。酶法制备MLCT具有反应条件温和、选择性好和副产物少等优势，但游离脂肪酶普遍存在环境敏感性高、稳定性差、难以回收等一系列局限性，严重制约了其工业化应用。物理吸附法固定化脂肪酶具有条件温和、操作简便、能较好保持酶结构与功能的优势。脂肪酶与疏水表面接触可诱导“盖子”结构打开并暴露活性位点从而提高酶的活性与稳定性。基于此，本研究通过乙醇溶解十二烯基琥珀酸酐（DDSA）对氨基树脂（HAA）进行疏水改性，并采用物理吸附法实现Rhizomucor miehei脂肪酶（RM）的固定化，结合SEM、水接触角、TGA、FT-IR、XPS、吸附动力学和吸附等温模型等方法对固定化体系进行分析，进一步应用于制备sn-2位富含DHA的MLCT，为开发环境友好且高效稳定的固定化脂肪酶体系提供了创新路径，同时也为精准合成具有高营养价值的结构脂质奠定了技术与理论基础。
- 采用环境友好策略开发了一种新型固定化脂肪酶HAA-DDSA-RM。
- HAA-DDSA-RM的酶活性是商业脂肪酶Lipozyme RM C的1.74倍。
- 结构脂质中sn-2位的DHA含量达到73.40%。
- HAA-DDSA-RM表现出优异的稳定性，10次循环后仍保持96%的活性。
固定化脂肪酶构建：以DDSA疏水改性HAA固定化RM。通过控制DDSA与HAA比例调节载体的亲/疏水性，确定DDSA与HAA的最适比例为0.04 mmol/g。固定化脂肪酶的最适工艺条件为：酶液/载体比例15:1 mL/g，固定化时间6 h，固定化温度40 ℃，pH=8.0。此时固定化脂肪酶HAA-DDSA-RM的酶活为13400 U/g，是商业化脂肪酶Lipozyme RM C的1.74倍，是未改性氨基树脂固定化脂肪酶（HAA-RM）的2.13倍。
固定化脂肪酶表征：SEM的成像说明HAA经疏水改性和固定化酶后孔道形貌并未被破坏，经DDSA疏水改性后HAA-DDSA的接触角大幅度增大，固定化酶后略微减小；TGA结果显示HAA-DDSA分解的起始温显著向高温区移动；FT-IR表明有新的酰胺键形成且固定化酶后信号增强；XPS图谱表明C-N键和N元素信号增强且有新的N-C=O键形成。以上表征结果均证明了HAA-DDSA改性成功、脂肪酶已成功固定化。
脂肪酶载体上的吸附行为：吸附动力学模型的线性回归分析表明固定化脂肪酶HAA-DDSA-RM的吸附动力学符合拟二级模型。吸附热力学模型的线性回归分析表明固定化脂肪酶HAA-DDSA-RM的吸附热力学符合Langmiur模型且升温有利于吸附行为发生。
富含DHA的中长链脂制备：以癸酸与藻油为原料，HAA-DDSA-RM为催化剂制备sn-2富含DHA的MLCT。通过单因素试验得到最适制备工艺参数为：癸酸与藻油摩尔比6:1，反应时间8 h，反应温度60 ℃，HAA-DDSA-RM添加量8%。在最适工艺参数下，sn-2富含DHA的MLCT总脂肪酸组成中癸酸含量为36.43%，DHA含量为44.55%；在sn-2脂肪酸组成中，DHA含量高达73.4%。与商业化脂肪酶Lipozyme RM C在相同条件下制备的sn-2富含DHA的MLCT相比，癸酸含量提高了17.71%，C10:0-C22:6-C10:0的含量提高了21.89%。
固定化脂肪酶的稳定性：HAA-DDSA-RM具有良好的热稳定性、储存稳定性和操作稳定性。在45 ℃和65 ℃孵育8 h后其酶活保留率分别为91%和84%；在4 ℃和25 ℃条件下储存30天，酶活保留率分别为94%和90%；在制备sn-2富含DHA的MLCT的最适工艺参数下，HAA-DDSA-RM循环使用10次后其酶活保留率为96%。
研究意义：本研究通过乙醇溶解DDSA对氨基功能化载体进行疏水改性，并在此基础上采用物理吸附法实现脂肪酶的固定化，研究系统考察了固定化脂肪酶的酶学动力学特性，并将其应用于酶法合成sn-2位富含DHA的中长链甘油三酯，为开发环境友好且高效稳定的固定化脂肪酶体系提供了创新路径，同时也为精准合成具有高营养价值的结构脂质奠定了技术与理论基础。
图1 （a）HAA-DDSA载体和固定化脂肪酶HAA-DDSA-RM的制备示意图；（b）不同比例（0.1–0.6 mmol/g）的DDSA疏水改性HAA对固定化脂肪酶HAA-DDSA-RM相对酶活、固定化效率和酶负载量的影响
图2 脂肪酶与载体比例（a）、固定化时间（b）、固定化温度（c）和pH值（d）对固定化脂肪酶HAA-DDSA-RM相对酶活、固定化效率和酶负载量的影响
图3 HAA、HAA-DDSA和HAA-DDSA-RM的扫描电子显微镜图像（a–c）及接触角（d–f）
图4 RM、HAA、HAA-DDSA和HAA-DDSA-RM的热重分析曲线（a）和傅里叶变换红外光谱（b）
图5 RM、HAA、HAA-DDSA和HAA-DDSA-RM的X射线光电子能谱总谱（a）；HAA-DDSA（b）和HAA-DDSA-RM（c）的C 1s高分辨XPS谱图；HAA（d）和HAA-DDSA（e）的N 1s高分辨XPS谱图
图6 癸酸与藻油摩尔比（a）、反应温度（b）、反应时间（c）和酶添加量（d）对MLCT脂肪酸组成的影响
图7 （a）HAA-DDSA-RM在45 ℃和65 ℃下孵育后的热稳定性；（b）HAA-DDSA-RM在4 ℃和25 ℃下的储存稳定性；（c）商业化Lipozyme RM C和HAA-DDSA-RM在最适条件下连续循环使用10次的操作稳定性
