【南昌大学食品学院食品营养与健康创新团队最新研究】筛选具有持续水解EGCG活性的单宁酶及其对三类茶汤澄清度与抗氧化活性的提升作用

筛选具有持续水解表没食子儿茶素没食子酸酯活性的单宁酶及其对三类茶汤澄清度与抗氧化活性的提升作用

近日，南昌大学食品学院食品营养与健康创新团队的硕士研究生曾欢、邓泽元教授、张鹏副教授等人在国际期刊Food Bioscience发表了题为“Screening of tannases with sustained epigallocatechin gallate hydrolytic activity and their improvement in the clarification and antioxidant activity of three different types of tea infusions”的文章。为获得在茶汤澄清中具有应用前景的单宁酶，本研究从不同进化分支筛选出四种单宁酶（Gt-Tan、SS-1、TanLp和TanSL），测定了不同单宁酶水解表没食子儿茶素没食子酸酯产物的抗氧化活性。其中SS-1水解EGCG产物的抗氧化活性最强，其DPPH与ABTS自由基清除率分别提升22.35%和28.54%。分子对接与分子动力学模拟分析表明，该现象可能归因于：（1）SS-1-EGCG复合物催化稳定性增强；（2）水解代谢产物（没食子酸与表没食子儿茶素）对酶的产物抑制作用减弱。进一步使用SS-1处理三种茶树品种（金骏眉、川茶、龙井茶）的茶汤，其DPPH与ABTS自由基清除率均提升约20%。此外，金骏眉与龙井茶中酯化型儿茶素（EGCG、ECG、GCG）降解率超过97%，水解产物（EGC、GC、EC及没食子酸）含量显著增加50%以上。因此，SS-1有望作为提升茶汤澄清度与抗氧化活性的酶制剂。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2212429225015688

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单宁酶（EC 3.1.1.20），亦称单宁酰基水解酶，通过水解单宁底物的酯键和缩酚酸键，催化释放没食子酸、鞣花酸及相应醇类。该酶广泛存在于动植物及微生物中，而商业化单宁酶主要源于真菌发酵。相较于真核表达系统，原核表达体系能以更低成本实现规模化生产，因此通过原核表达制备单宁酶已成为新发展趋势。自发现以来，单宁酶已应用于食品、饮料、医药及饲料等多个行业。在食品饮料领域，单宁酶主要用于澄清茶饮、葡萄酒、苹果酒等产品，通过降低涩味与苦味改善风味及感官品质。例如，曹等人通过在绿茶加工中添加单宁酶降低了茶叶苦味。

由于绿茶加工过程未经发酵，其天然活性成分保留最为完整，因而对多种疾病（包括不同癌症、心脏病及肝病）具有健康益处。这也使得绿茶富含多酚类化合物、蛋白质及有机酸等生物活性物质。多酚类化合物通常称为儿茶素，主要包括酯型儿茶素（如EGC、ECG、EC及EGCG）。研究表明儿茶素因其抗氧化与抗肿瘤特性具有健康优势，但酯型儿茶素易与蛋白质、矿物质等大分子物质形成复合物导致聚集沉淀，因此利用单宁酶催化水解酯型儿茶素为应对这一挑战提供了可行方案。

尽管单宁酶在提升茶汤感官品质方面展现出巨大潜力——通过水解儿茶素提高抗氧化活性、防止沉淀形成、改善色泽外观及整体感官接受度，从而增强消费者接受度。例如，Mostafa等人通过使用单宁酶及优化制备条件降低了洛神花茶的鞣质含量并改善了茶汤口感；在茶饮中添加单宁酶可降低酯型儿茶素含量，同时增强茶饮抗氧化活性并提升营养价值。然而，单宁酶在茶汤加工中成本较高，且其作用机制尚未完全阐明。因此，开发可行的单宁酶筛选方法并明确其在茶汤中的功能机制具有重要意义。

本研究首先对已发表的细菌源单宁酶进行系统进化树分析，筛选出来自四个不同进化分支的单宁酶（Gt-Tan、SS-1、TanLP和TanSL）用于后续研究。同时，全面分析了这四种单宁酶对EGCG的持续水解能力，并通过分子动力学模拟与分子对接解析其催化机制。进一步系统比较了SS-1对三种代表性茶树品种茶汤的影响。新鉴定的单宁酶在提升茶汤品质方面展现出显著潜力，为茶产业酶制剂的开发提供了新思路。

1）、单宁酶的筛选与表达

为筛选能有效提升茶汤澄清度的单宁酶，本研究从系统进化树的不同分支中选取四种单宁酶进行比较分析（图1A）。根据一级结构预测，四种单宁酶的不稳定指数均低于40，表明其稳定性良好。序列比对显示Gt-Tan、SS-1、TanLp和TanSL的序列一致性介于26.62%至49.8%之间。同时，所有酶均含有丝氨酸水解酶特征性保守活性位点基序“Gly-X-Ser-X-Gly”。通过SDS-PAGE分析确认了四种单宁酶的可溶性表达（图1B、C、D），其成功表达与纯化为后续研究提供了基础。

2）、DPPH与ABTS自由基清除能力

茶汤富含茶多酚，其中EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）是茶多酚中含量最丰富的组分。EGCG是一种具有抗癌和抗氧化作用的多酚类物质，但同时也是茶汤沉淀产生的主要原因。因此，降低茶汤中EGCG含量可改善其感官品质。研究发现，EGCG水解产物的抗氧化活性可提升14%至50%。

EGCG在茶汤澄清中起着关键作用，其水解产物能提升抗氧化活性与感官品质。因此，通过探究EGCG水解前后抗氧化活性的变化，初步筛选了上述四种单宁酶在茶汤澄清中的作用。如图2所示（p < 0.05），与其他三种单宁酶相比，经SS-1水解的EGCG产物体系的DPPH和ABTS抗氧化活性分别提升约22.35%和28.54%。SS-1水解的EGCG产物抗氧化活性显著增强，表明该酶可能具备减少茶汤沉淀生成并提升茶汤抗氧化活性的优异能力。类似地，有报道称真菌单宁酶与EGCG共孵育可显著提升酶反应产物的抗氧化活性。这些研究为通过添加单宁酶水解EGCG以减少茶汤沉淀生成并增强其抗氧化活性提供了依据。

3）、SS-1的结构特征与分子基础

为了分析SS-1具有相对稳定的EGCG催化活性的潜在机制，进行了分子动力学模拟和分子对接，以阐明SS-1与其他三种单宁酶之间催化活性的差异。使用AlphaFold2对Gt-Tan、SS-1、TanLp和TanSL的三维结构进行了建模。

此外，分别对Gt-Tan-EGCG、SS-1-EGCG、TanLp-EGCG和TanSL-EGCG形成的复合物进行了分子动力学模拟。如图3A所示，每个复合物的RMSD波动随时间减小并达到平衡，表明结构在模拟过程中逐渐稳定。然而，SS-1-EGCG复合物的RMSD值高于其他三个复合物。在0-10 ns的时间间隔内，SS-1-EGCG复合物的RMSD值从0迅速增加到0.9615 Å的平衡值，该值高于EGCG与Gt-Tan、TanLp和TanSL形成的复合物的RMSD值（分别为0.4172 Å、0.1396 Å和0.6496 Å）。该结果表明，SS-1-EGCG复合物在催化过程中表现出更大的柔性，这有利于催化反应。同时，溶剂可及表面积从初始值282.36 Ų减少到平衡值247.31 ± 3.04 Ų，表现出趋向稳定和紧密的趋势，表明构象趋于稳定和紧密。RMSF分析显示，SS-1的N端区域00-50和TanSL的350-400区域表现出轻微的波动（RMSF > 1 Å）；SS-1的N端区域40-50位于单宁酶“池”结构底部的β-折叠区，其柔性的变化可能有助于底物的结合和产物的释放。TanSL的柔性变化区域位于活性位点残基处，表明该区域可能参与底物诱导的构象变化。

如图3B所示，SS-1的SASA值处于平均水平，这可能是SS-1能够持续水解EGCG的原因之一。对Gt-Tan、SS-1、TanLp和TanSL与EGCG形成的复合物进行了蛋白质-底物相互作用分析。进一步分析了不同单宁酶与EGCG之间的弱相互作用。SS-1与EGCG之间的氢键数量显著高于Gt-Tan-EGCG、TanLp-EGCG或TanSL-EGCG。更多氢键的存在使SS-1能够以更高的特异性识别EGCG底物，从而避免非特异性结合。这也证实了与其他三种单宁酶相比，SS-1在催化EGCG水解方面更有效。因此，SS-1-EGCG复合物的构象柔性及其更强的氢键作用使得SS-1更适合EGCG水解。

同时，进行分子对接以进一步分析SS-1与其他三种单宁酶之间催化活性的差异。分子对接显示，Gt-Tan、SS-1、TanLp和TanSL与EGCG结合口袋的结合能差异较小，分别为-5.8、-5.5、-5.1和-5.4 kJ/mol。然而，它们与EGCG的分子间相互作用存在显著差异。如图4所示，SS-1仅通过常规氢键和硫-π相互作用结合EGCG，而其他单宁酶通过超过5种不同类型的分子相互作用与EGCG结合。上述四种单宁酶与EGCG之间形成的相互作用力类型差异显著，表明它们的水解机制可能存在差异。这也与分子动力学模拟的结果一致。这可以确保SS-1在催化过程中的柔性，与SS-1-EGCG的RMSD结果一致。

4）、SS-1处理茶汤的澄清化

澄清度是众多茶制品的一个关键质量属性，很大程度上取决于水溶液中悬浮胶体颗粒的水平。因此，通过将SS-1掺入各种茶汤中来增强其澄清度。如图6A、B和C所示，经SS-1（1.2 U/mL）处理后，金茶、川茶和龙井茶的透光率分别提高了2.35%、3.33%和0.89%。同时，增加单宁酶浓度显著提高了金茶的澄清度，而对川茶和龙井茶澄清度的影响可忽略不计。此外，反应30分钟后，不同茶汤的澄清度没有发生显著变化。

绿茶茶汤中参与沉淀形成的主要物质是酯型儿茶素，这是因为与非酯型儿茶素相比，它们拥有更多的结合位点，因此更容易与咖啡因结合形成不溶性复合物。同时，酯型儿茶素还可以通过疏水相互作用和氢键与茶汤中的氨基酸形成复合。因此，可以通过添加单宁酶来减少茶汤中的酯型儿茶素含量，从而减少沉淀的产生。

5）、单宁酶水解对茶汤抗氧化活性的影响

随后，使用DPPH自由基清除法（图6D、E和F）和ABTS自由基清除法（图6G、H和I）测定了川茶、金茶和龙井茶在酶处理后的抗氧化活性变化。由于不同茶汤的组成存在显著差异，酶处理对各种茶汤的影响也各不相同。其中，低浓度单宁酶几乎不影响金茶的抗氧化活性。然而，当酶浓度增加到0.8 U/mL时，水解120分钟后，金茶的ABTS自由基清除活性提高了25%，DPPH自由基清除活性也提高了6%。由于不同茶汤中多酚种类的差异，低浓度酶即可显著提高川茶和龙井茶的抗氧化活性。同时，随着酶浓度的增加，茶汤的抗氧化活性也得到提高。

茶强大的抗氧化活性被认为是其健康益处的主要因素。基于上述结果，添加适量单宁酶显著提高了茶汤的抗氧化活性。总之，添加一定量的单宁酶可以增加茶汤中的抗氧化活性，并改善茶汤的澄清度。

6）、单宁酶水解后的茶汤组分

经SS-1处理后，金茶、川茶和龙井茶的澄清度和抗氧化性能显著提高。研究发现，单宁酶处理后，绿茶提取物中的总多酚含量显著增加，同时该酶能有效将酯型儿茶素降解为非酯型儿茶。为了探究SS-1处理后不同茶汤发生变化的原因，采用UPLC-ESI-QTOF-MS分析了处理前后茶汤组成和含量的变化。

如表1所示（p < 0.05），在川茶中通过UPLC-ESI-QTOF-MS共鉴定出19种黄酮类衍生物，包括8种儿茶素、6种黄酮醇/黄酮醇苷、2种原花青素、2种酚酸和1种可水解单宁化合物。经SS-1处理120分钟后，川茶中EGCG、ECG和GCG的水解程度相对较低，降解率分别为9.06%、11.85%和16.96%。不同茶叶中酯型儿茶素水解程度相对较低可能归因于各种茶叶组成的差异。

在金茶中鉴定出共20种黄酮类衍生物，包括8种黄酮醇/黄酮醇苷、7种儿茶素、4种酚酸和1种可水解单宁化合物（p < 0.05，表2）。使用峰面积测量了每种化合物含量的相对变化。经SS-1处理120分钟后，茶汤中EGCG、ECG和GCG的水平显著降低，降解率分别为99.91%、99.79%和99.64%。同时，相应的水解产物水平大幅增加，EGC、EC、GC和GA分别上升了106.37%、102.7%、51.81%和179.73%。值得注意的是，GA的增加幅度最大，这可能是因为单宁是茶中含量最丰富的多酚类化合物之一，而GA是单宁的主要水解产物。

如表3所示（p < 0.05），在龙井茶中共鉴定出20种黄酮类衍生物，包括8种儿茶素、6种黄酮醇/黄酮醇苷、3种酚酸、2种原花青素和1种可水解单宁。与金茶类似，龙井茶中的酯型儿茶素EGCG、ECG和GCG几乎完全水解，降解率分别为98.48%、99.27%和97.46%。同时，水解产物EGC、EC、GC和GA的含量分别增加了67.61%、55.04%、57.73%和76.62%。总之，经SS-1处理后，茶汤中儿茶素的水平发生了显著变化。其中，金茶和龙井茶中酯型儿茶素EGCG、ECG和GCG的水解率超过97%，这导致了茶汤抗氧化活性和透明度的显著变化。这些研究表明，SS-1可以通过水解茶汤中的酯型儿茶素来提高茶叶品质，暗示其在茶叶加工和生产中具有广阔的应用前景。

7）、感官评价

最后，使用电子鼻和电子舌对三种茶汤在酶解前后的风味特征进行了感官评价。其中，金茶、川茶和龙井茶在酶解后的甜度均有所下降。这可能是由于茶汤中甜味物质的含量发生了变化。然而，酶解前后不同茶汤的挥发性香气成分和滋味没有显著差异。因此，在上述三种茶汤中的任何一种中添加1.2 U/mL的SS-1都不会显著改变茶叶的感官特性。

在本研究中，通过筛选获得了对EGCG具有优异持续催化能力的单宁酶SS-1。结果发现，与其他三种单宁酶相比，SS-1与EGCG之间的相互作用类型更少，表明SS-1在催化过程中具有更高的柔性。SS-1与GA和EGC形成4个氢键相互作用，而与EGCG形成多达5个氢键相互作用。这表明在与GA和EGC的竞争结合过程中，EGCG更有可能与SS-1形成稳定的复合物，这有利于催化反应的进行。SS-1对金茶和龙井茶中EGCG、GCG和ECG的降解率超过97%，其相应水解产物EGC、GC、EC和GA的含量增加超过50%。这些发现表明SS-1能有效改善茶汤品质，并为开发相关酶制剂提供了有价值的新见解。

曾欢 硕士

曾欢，食品科学硕士在读。以第一作者发表SCI论文3篇，主要研究方向为酶工程。

张鹏 副教授

张鹏，博士，副教授，硕导，南昌大学赣江青年学者，南昌市科技特派员，JAFC、JSFA等杂志审稿人。近年来发表论文10余篇，其中以第一作者身份在Journal of Agricultural and Food Chemistry、Scientific Reports等SCI上发表6篇；参编英文著作1部、中文著作1部；目前主持国家青年基金项目1项、江西省自然科学青年基金项目1项、参与国家自然科学基金面上项目1项、地区项目1项、江西省农业支撑项目1项、企业横向项目3项。

邓泽元  教授

邓泽元，二级教授，博士生导师。南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室固定研究人员。享受国务院特殊津贴，赣鄱英才555工程人才、江西省新世纪百千万人才工程人选，江西省高校中青年学科带头人，首届江西省优秀硕士指导教师，江西省高等学校教学名师，获得教育部优秀中青年教师（支助），江西省主要学科学术与技术带头人，“食品科学”与“营养与食品卫生学”重点学科带头人。现任中国农学会微量元素与食物链分会副理事长，中国粮油学会营养分会副会长，中国营养学会营养转化医学分会副主任委员，江西省微量元素与健康研究会名誉理事长，江西省营养学会理事长；美国化学学会（ACS）会员、国际食品学会（IFT）会员，《食品科学》、《农产品加工学刊》、《食品安全质量检测学报》、《乳业科学与技术》、《南昌大学学报》（理科版）、J of Agri. Food Chem.和J of Food Biochem.编委，中国保健食品评审专家。

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