南昌大学黄俊团队 | USP46-MCM7-RAD51轴通过增强同源重组修复能力赋予结肠癌奥沙利铂耐药性

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结肠癌是全球发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一，近70%患者确诊时已处于晚期，化疗耐药是制约临床疗效的核心瓶颈。奥沙利铂作为晚期结肠癌一线化疗药物，其耐药常与DNA同源重组修复（HRR）异常激活密切相关。去泛素化酶USP46在多种肿瘤中发挥促癌或抑癌双重作用，但其调控结肠癌奥沙利铂耐药的具体机制尚未阐明。近日，南昌大学第二附属医院黄俊团队在ABBS生物化学与生物物理学报(Acta Biochimica et Biophysica Sinica)发表题为"The USP46-MCM7-RAD51 axis confers oxaliplatin resistance in colon cancer by augmenting homologous recombination repair capacity“的研究论文。该研究首次证实，USP46在结肠癌组织中显著高表达并与不良预后相关；USP46通过去泛素化稳定MCM7蛋白，进而促进RAD51核转位与焦点形成，增强HRR能力，最终介导奥沙利铂耐药。靶向抑制USP46可有效逆转结肠癌耐药，为临床克服奥沙利铂耐药提供全新治疗靶点与联合策略。

基于TCGA数据库分析显示，USP46在结直肠癌等多种肿瘤中异常高表达。TISCH单细胞测序数据表明，USP46主要在结肠癌组织的恶性细胞、免疫细胞中富集，与癌旁正常组织表达模式显著不同。研究收集96对结肠癌及配对癌旁正常组织，qRT-PCR、Western blot及免疫组化（IHC）结果一致证实，USP46在结肠癌组织中的mRNA与蛋白水平显著高于癌旁组织。临床病理参数分析显示，USP46高表达与结肠癌TNM分期显著相关。Kaplan-Meier生存分析表明，USP46高表达患者总生存期更短，提示USP46是结肠癌不良预后的潜在生物标志物（图1）。

图1. USP46在结肠癌组织和细胞中高表达并导致不良预后

qRT-PCR与Western blot检测到，相比于正常结肠黏膜细胞，结肠癌细胞中 USP46 表达广泛显著高表达。构建 USP46过表达，以及 USP46敲低的稳转细胞株。CCK-8实验显示，敲低USP46显著降低奥沙利铂IC50，提升药物敏感性；过表达USP46则降低细胞对奥沙利铂的敏感性。Western blot结果表明，敲低USP46上调促凋亡蛋白BAX、下调抗凋亡蛋白 BCL2，过表达则呈现相反效应，奥沙利铂联合处理可进一步放大凋亡相关蛋白变化。EdU、克隆形成实验证实，USP46过表达促进结肠癌细胞增殖，敲低或奥沙利铂处理则抑制增殖。流式细胞术显示，USP46可减轻奥沙利铂诱导的细胞凋亡（图2）。

图2. USP46在体外导致结肠癌细胞产生化疗耐药

构建裸鼠皮下异种移植瘤与尾静脉肺转移模型，分别植入USP46敲低细胞与 USP46过表达细胞。皮下成瘤实验显示，敲低USP46显著抑制肿瘤生长，过表达则加速肿瘤增殖；奥沙利铂给药可有效抑制两组肿瘤生长。IHC检测发现，USP46过表达上调增殖标志物Ki67与抗凋亡蛋白BCL2，敲低或奥沙利铂处理则下调上述蛋白。肺转移实验经H&E染色证实，USP46敲低显著减少肺转移灶数量与体积，过表达则显著增强肺转移能力。体内结果充分验证，USP46在体内驱动结肠癌增殖、转移并介导其奥沙利铂耐药（图3）。

图3. USP46在体内促进结肠癌转移与化疗耐药

RAD51是同源重组修复（HRR）通路核心蛋白，其核内焦点形成是HRR激活的关键标志。研究发现，敲低USP46显著降低核内RAD51蛋白水平与RAD51焦点形成数量。使用RAD51激动剂RS-1可部分逆转 USP46 敲低导致的RAD51下调、增殖抑制与凋亡增加；RAD51抑制剂RI-1则可部分阻断USP46过表达的促癌与耐药效应。功能实验证实，USP46通过提升核内RAD51水平、激活HRR通路，增强结肠癌细胞DNA损伤修复能力，进而介导奥沙利铂耐药（图4）。

图4. USP46调控RAD51激活HRR促进结肠癌奥沙利铂耐药

采用USP46免疫沉淀联合质谱（IP-MS）筛选，鉴定出MCM7是USP46的潜在结合底物。免疫荧光（IF）实验显示USP46与MCM7在结肠癌细胞中共定位，内源性与外源性co-IP实验进一步证实二者存在直接相互作用。临床组织样本检测发现，MCM7在结肠癌中同样高表达，且与USP46表达呈正相关。敲低或过表达USP46仅改变MCM7蛋白水平，对其mRNA无显著影响，提示USP46可能在转录后水平调控MCM7（图5）。

图5.  USP46调控MCM7表达

泛素化IP实验证实MCM7是泛素化蛋白。分别使用蛋白酶体抑制剂MG132与溶酶体抑制剂CQ处理细胞，发现使用MG132后可MCM7蛋白出现显著上调，CQ无明显作用，且MG132可逆转 USP46 敲低导致的MCM7下调。蛋白合成抑制剂 CHX追踪实验显示，敲低USP46加速MCM7蛋白降解过表达则延缓降解。泛素化实验表明，USP46敲低显著增加MCM7泛素化水平，过表达则降低其泛素化。泛素突变体实验证实，USP46 特异性切割MCM7上K48位连接的多聚泛素链，阻断其蛋白酶体降解途径，稳定MCM7蛋白（图6）。

图6. USP46 抑制泛素化途径介导的 MCM7 降解

回复实验验证通路上下游关系：在USP46敲低细胞中过表达MCM7，可部分恢复核内RAD51水平、RAD51焦点形成，逆转奥沙利铂耐药表型；在USP46过表达细胞中敲低 MCM7，则抑制RAD51核转位。CCK-8、克隆形成、EdU及凋亡实验一致证实，MCM7是USP46调控RAD51与HRR通路的关键中间分子。USP46通过稳定MCM7，促进RAD51核聚集与焦点形成，最终增强同源重组修复，介导结肠癌奥沙利铂耐药（图7）。

图7. USP46通过调控MCM7促进RAD51核表达

本研究首次揭示USP46-MCM7-RAD51调控轴介导结肠癌奥沙利铂耐药的全新分子机制：USP46 通过去泛素化稳定 MCM7，促进 RAD51 核转位与 HRR 通路激活，增强 DNA 损伤修复能力，最终导致耐药。该发现不仅完善了泛素化修饰调控肿瘤化疗耐药的理论体系，更将 USP46 确立为逆转奥沙利铂耐药的关键靶点。未来靶向 USP46 的小分子抑制剂联合奥沙利铂，有望成为晚期结肠癌耐药患者的新型治疗方案，为提升临床疗效、改善患者预后提供全新思路。

通讯作者：黄俊

黄俊，医学博士、主任医师、博士研究生导师、美国华盛顿大学博士后。中国医师协会外科医师分会肛肠外科医师委员会委员、中国抗癌协会胃癌专业委员会青年委员、中国医师协会外科医师分会TaTME委员会委员。长期从事消化道肿瘤化疗耐药与靶向治疗研究，聚焦泛素化修饰、DNA 损伤修复调控肿瘤恶性表型的机制探索，主持2项国家自然科学基金及2项省部级课题，以通讯 / 第一作者在Cell Commun Signal，Cancer Cell Int等多个国际权威肿瘤学期刊发表多篇高水平论文，研究成果为消化道肿瘤耐药机制解析与靶向药物开发提供重要理论与实验支撑。